【摘 要】
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来源于嗜热菌的酶类具有极好的高温反应活性和稳定性,在能源、化工、食品和医药等行业展现出越来越广阔的应用潜力。解析嗜热酶及酶-底物复合物的晶体结构,研究其结构特征,将有助于揭示酶超常生物学稳定性以及高温催化反应机制的分子基础,为发掘嗜热酶的新功能、指导酶分子设计和改造等工作提供必要的理论依据。论文第一部分运用分子生物学技术克隆、表达、纯化了来源于嗜热菌Fervidobacterium nodosum
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来源于嗜热菌的酶类具有极好的高温反应活性和稳定性,在能源、化工、食品和医药等行业展现出越来越广阔的应用潜力。解析嗜热酶及酶-底物复合物的晶体结构,研究其结构特征,将有助于揭示酶超常生物学稳定性以及高温催化反应机制的分子基础,为发掘嗜热酶的新功能、指导酶分子设计和改造等工作提供必要的理论依据。论文第一部分运用分子生物学技术克隆、表达、纯化了来源于嗜热菌Fervidobacterium nodosum Rt17-B1的嗜热β-1,4-葡聚糖内切酶FnCel5A及其N末端截短突变体FnCel5AND,并运用蛋白质晶体学的技术进行结晶,最终使用单波长反常散射法解析了分辨率达1.7 ?的FnCel5A和2.2 ?的复合物FnCel5AND:Glucose的晶体结构。结构分析表明,该酶具有糖基水解酶第五家族典型的（β/α）8形式TIM桶状结构;与中温和低温结构同源物比较,FnCel5A在氨基酸组成和分子内相互作用等方面具备高稳定性酶的结构特征;确定了Glu283-His126和Glu167-His226双催化活性中心,以及底物结合残基;结合分子模拟,提出了FnCel5A与底物结合的模型,阐明了该酶水解直链糖底物的催化机理。论文第二部分克隆、表达、表征了来源于嗜热古菌的酰基肽水解酶N末端截短突变体ApAPH-ΔN21;结晶并利用分子置换法解析了2.5 ?分辨率的突变体结构。结构分析和性质测定结果显示,ApAPH-ΔN21较野生型的最适反应温度降低18℃,对热和化学变性剂抗性降低;平均结构B因子由野生型的19.4 ?2升高到突变体的28.4 ?2。以上证据表明保守的N末端的对于保持ApAPH或家族中其他成员的稳定性具有重要作用。
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