论文部分内容阅读
植物在生长发育过程中通常会遭受各种生物与非生物胁迫,如干旱、低温、病原菌等。因此,植物进化出一系列的防御机制来抵御各种逆境胁迫,其中病程相关蛋白10(pathogenesis-related protein 10,PR10)的激活和积累是植物参与防御反应的重要组成部分。本研究根据岷江百合(Lilium regale Wilson)受尖孢镰刀菌(Fusarium oxysrirum 侵染过程的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)cDNA文库中编码PRl0的表达序列标签(expressed sequence tag,EST)序列,利用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得9个岷江百合PR10的全长cDNA序列。利用生物信息学分析,了解该基因家族及其编码蛋白质的特性。通过实时定量逆转录PCR(Quantitative real-time reverse transcriptase PCR,QRT-PCR)检测岷江百合PR10基因家族成员的表达模式。构建LrPR10-5基因原核表达载体,诱导表达并纯化目的蛋白,检测重组目的蛋白的体外核糖核酸酶活性。利用染色体步移(Genomic walking)技术克隆出LrPR10-5启动子序列,并预测启动子序列中的顺式作用元件。同时构建启动子5’缺失片段融合GUS基因植物表达载体,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum),并获得转基因阳性株,利用GUS荧光定量检测LrPR10-5启动子在植物激素、生物与非生物处理后的启动子活性。此外,构建LrPR10-5植物超表达载体,将LrPR10-5基因转入烟草中超表达,再以LrPR10-5转基因烟草T1代株系为材料,研究转基因烟章的抗病性及核糖核酸酶活性。本论文的研究工作及得到的主要结果如下:1.利用RACE克隆获得9个岷江百合PR10的全长cDNA序列,通过生物信息学分析,该家族成员的cDNA全长在696～956 bp之间,编码具有156或157个氨基酸残基的蛋白质序列。聚类分析表明岷江百合PR1川基因家族中大部分成员存在“P-loop”基序以及三个保守氨基酸残基。系统进化树分析显示该家族成员与单子叶植物PR10聚成一大支,其中9个岷江百合PR10家族成员分为两个小支。2.QRT-PCR分析表明,9个岷江百合PR10成员的表达量在正常生长状态下的岷江百合根中较高,叶和茎中偏低。乙烯(ethylene,ET)、水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)和H202四种信号分子处理抑制了LrPR10-3、LrPR10-4、LrPR10-8和LrPR10-9的表达,上调了其余成员的表达量。在尖孢镰刀菌侵染抗病岷江百合和感病西伯利亚百合后不同的时间段中,9个岷江百合PR10基因的表达水平不尽相同,LrPR10-2、LrPR10-4、LrPR10-5、LrPR10-6、LrPR10-7和LrPR10-9的表达量在岷江百合中被尖孢镰刀菌侵染显著诱导。然而,尖孢镰刀菌侵染使LrPR10-1、LrPR10-3和LrPR10-8在西伯利亚百合中表达水平升高。3.构建原核表达载体pET-32a-LrPR10-5,热激转化大肠杆菌BL21(DE3),在30℃、0.1 mM IPTG诱导表达4 h获得大小为27 KDa的可溶性重组蛋白。经SDS-PAGE检测后,利用Ni-NTA柱纯化LrPR10-5重组蛋白。体外核糖核酸酶活性测定结果表明,LrPR10-5重组蛋白具有核糖核酸酶活性。4.利用染色体步移技术克隆出岷江百合LrPR10-5基因上游1 533 bp的启动子片段。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在与逆境胁迫相关的顺式作用元件。为了确定启动子的活性,本研究构建LrPR10-5启动子3个5’端缺失片段,分别与葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)报告基因融合,构建植物表达载体。采用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因阳性植株。基于预测的顺式作用元件,采用相应的植物激素、生物和非生物胁迫处理转基因烟草植株,并分别对5’端缺失片段转基因烟草进行GUS荧光定量分析,检测结果表明,3个片段的启动子均具有启动活性且随着启动子片段长度的增加,转基因烟草根部GUS活性也相应的增加。并且,LrPR10-5启动子响应几种非生物、生物胁迫及几种植物激素的处理。5.构建LrPR10-的植物超表达载体pCAMBIA2300S-LrP10-5,将质粒转入烟草中超表达并成功获得T1代转基因烟草阳性植株。QRT-PCR结果表明LrPR10-5在5个转基因烟草株系中稳定表达。平板抑菌实验证实,转入LrPRR10-5基因的烟草叶片粗蛋白均不同程度的抑制了核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌丝的生长。活体抑菌实验结果显示,供试的LrPR10-5转基因烟草植株较野生型烟草植株对尖孢镰刀菌抗性强。转基因烟草叶片粗蛋白的核糖核酸酶活性检测结果表明,转基因烟草的核酸酶活性在受到尖孢镰刀菌侵染后显著增强。上述实验结果显示,岷江百合PR10基因家族成员响应几种逆境胁迫相关信号分子,并参与抗尖孢镰刀菌的防卫反应。其中LrPR10-5受JA、ET和H202信号分子的诱导调控,并且可被尖孢镰刀菌诱导表达。原核表达LrPR10-5重组蛋白具有体外核糖核酸酶活性。转入LrPR10-5启动子5’端缺失片段的烟草植株经植物激素、生物与非生物胁迫处理后,可使启动子的启动活性明显增强。LrPR10-5在烟草中超表达可增强烟草对尖孢镰刀菌的抗性,并且尖孢镰刀菌侵染可上调转基因烟草的核糖核酸酶活性。对岷江百合中的PR10基因家族的功能研究,为深入地探究岷江百合的抗病分子机理提供重要的参考,同时也为植物基因工程提供可用的基因资源。