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运用CAR T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)治疗肿瘤的方法是近年来发展最为迅速的一种肿瘤免疫新疗法。CAR T细胞疗法能克服局部免疫抑制,对肿瘤细胞的杀伤不受MHC(major histocompatibility complex)限制等优势,但同时也必须面对在治疗过程中产生的细胞因子释放综合症(CRS)、脱靶效应和神经毒性等因素的困扰。因此CAR T细胞治疗技术的有效性和安全性还需要研究人员去严格把控。由于CAR T生产过程中细胞培养环境的多样性使得CAR T产品中的杂质复杂多样,即使微量的杂质残留都可能会在人体中产生严重的免疫反应,其中DNA残留是最主要的杂质。残留的外源DNA可能造成插入突变、导致抑癌基因失活、癌基因被激活等,而至今还没有一种全面、准确、合规的检测方法能评价CAR T中间产品—慢病毒载体中的DNA残留。因此本文将采用荧光染料法和qPCR法对慢病毒载体生产和纯化工艺中的样品进行DNA残留检测。PicoGreen荧光染料法检测DNA残留具有检测快速、成本低的特点,但其灵敏度不高,对于特定DNA残留如SV40和E1A等也缺乏有效的检测方法,而qPCR法虽具备特异性强、灵敏度高的特点,却存在只能检测宿主细胞(CHO、Ecoli、Vero),不能检测293T细胞总DNA残留的缺点。为了能更好的完善CAR T生产纯化工艺,全面检测慢病毒载体中的DNA残留,为将来CAR T技术更好地运用于临床实验当中去。本文先运用荧光染料法建立了三套不同的检测范围和灵敏度的总DNA残留检测方法,并针对于实际慢病毒载体生产样品的浓度,选取25~800 ng/mL检测范围的检测方法进行准确度、精密度、专属性、稀释线性和耐用性的验证。随后运用qPCR法通过探针引物的选择、优化,DNA抽提效率的考察后建立了针对于SV40、E1A DNA残留检测的方法,并对这两种方法进行了准确度、精密度、专属性、和耐用性的验证,通过联合运用荧光染料法和qPCR法对慢病毒载体中的DNA残留进行全面、准确、快速、高效的检测。