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钾离子通道与诸多生理病理功能密切相关。在不同类型钾离子通道中,KCNQ钾通道是一种电压门控型(Kv)钾离子通道,它包括五个成员：KCNQ1(又名Kv7.1),KCNQ2(又名Kv7.2),KCNQ3(又名Kv7.3),KCNQ4(又名Kv7.4),KCNQ5(又名Kv7.5)。研究发现,KCNQ通道的五个亚家族成员中,有四个KCNQ通道亚型与人类重大疾病相关。KCNQ1的突变与长QT综合症相关,该疾病常常伴随着心率不齐,心源性猝死等；KCNQ2通道和KCNQ3通道的突变则会引起良性家族性婴儿惊厥；KCNQ4通道的突变则会引起先天性耳聋。尽管KCNQ通道功能研究取得了重要进展,但其结构与功能关系研究显著滞后,一个重要的原因是KCNQ通道仍未发现一个多肽类调节剂。蝎是现存最古老的节肢动物之一,其生存历史已经有四亿多年。在中国传统医药中,东亚钳蝎是一味重要的药材；现代分子生物学和生物化学的研究发现,蝎子毒腺是一个巨大的多肽宝库,其毒素多肽数目可能超过一万种,但是大量不同类型蝎毒素多肽的作用靶标有待鉴定。鉴于钾通道KCNQ1和蝎毒素的研究现状,本课题拟综合运用生物信息学和实验技术,合理筛选并设计新型的靶向KCNQ1通道的特异性多肽调节剂。首先,本论文分析了KCNQ1通道多肽作用区域的结构特征。通过不同亚型的钾通道序列比对发现,钾通道Kv1.x,小电导钙激活钾通道SKCa1-3,大电导钙激活钾通道BKCa等在通道孔区上方附近都含有一个保守的酸性氨基酸Asp残基,使得这些通道在孔区的区域形成了局部的强负电荷场,从而允许含有大量碱性功能残基的蝎毒素多肽与钾离子通道键合。与Kv1.x等通道不同的是,KCNQ1钾通道在孔区部分不仅拥有一个酸性的Asp317残基,同时还含有一个带正电荷的Lys318残基,这一独特的序列特征可能导致含有大量碱性残基蝎毒素的不敏感性。在蝎钾毒素家族中,除了一类分子内富含碱性残基毒素多肽外,还有一类功能未知的分子内富含酸性残基毒素肽(简称“酸性钾毒素”)。据此,推测酸性钾毒素是钾通道KCNQ1潜在的调节剂。其次,筛选了系列作用钾通道KCNQ1的酸性钾毒素,并对其中六个代表性酸性钾毒素进行了功能鉴定。本论文运用pGEX-6p-1表达载体,构建了六个蝎毒肽与GST融合表达的重组表达载体,利用原核表达系统获得融合蛋白,经亲和层析纯化、超滤脱盐浓缩、蛋白酶酶切、色谱纯化等步骤获得了色谱纯的重组蝎毒肽。经质谱法测定,重组酸性钾毒素的理论分子量与测定分子量一致。在此基础上,运用电生理实验分别测定六个酸性钾毒素与钾通道KCNQ1的相互作用,结果显示：10μM的Im104, Lmk2,23, 32,BmP01,Pbtx1对KCNQ1通道电流抑制率分别为29.1%,23.4%,15.8%,33.0%,9.7%,30.7%；而10μM的Im104, Lmk2,23,32, BmP01, Pbtx1对KCNQ1+mink (mink为通道的辅助亚基)形成的Iks电流的抑制程度分别为37.7%,27.7%,4.2%,22.0%,4.8%,21.4%。从整体上看,这六个酸性毒素对KCNQ1通道电流以及Iks电流的抑制程度均不好,只是在10μM的毒素级别上有明显的抑制作用。随后,采用M9基本培养基制备了2.5mg的”N标记的rIm104,运用多维核磁共振技术测定了其中一个酸性钾毒素Im104的三维结构。结果显示：多肽Im104在溶液中可以形成较为稳定的构象,二硫键配对方式为C1-C4、C2-C5、C3-C6。有趣的是,酸性钾毒素Im104的主链在整体走向上与大多数蝎a-KTX毒素类似,但是其二级结构特征并不明显,尤其是缺乏明显的p-折叠,相对于经典的碱性钾毒素,酸性钾毒素Im104在结构上呈现更大的柔性。再次,分子设计并鉴定了作用钾通道KCNQ1的蝎毒素。基于分子内富含酸性和碱性残基蝎毒素药理学活性差异基础上,本论文综合考虑了KCNQ1通道的多肽靶区域结构和性质特征,提出了新的设计思路：(1)保持毒素突变体在整体上呈现弱碱性；(2)保持毒素多肽的分子极性；(3)针对性地改变毒素多肽局部氨基酸,以适应KCNQ1通道Turret区域的氨基酸分布。在此基础上,以分子内富含碱性残基ADWX-1 (PDB code:2K4U)为模板,设计了新的毒素突变体ADWX-T1(简称T1),ADWX-1与T1主要有6个残基差异(K6A,K8N,H9E,K15N,K18G,R23E)。通过基因工程方法成功地获得了重组T1毒素多肽,经质谱鉴定,其测定分子量与理论值一致。电生理实验发现T1毒素多肽作用于KCNQ1通道的ICso为4.6±1.9μM。与酸性钾毒素相比,T1毒素多肽的药理学活得到了有效的提高。此外,我们也鉴定了高浓度模板毒素多肽ADWX-1对KCNQ1通道几乎没有作用。T1毒素多肽较好活性为设计高特异性KCNQ1多肽调节剂确定了方向。综上述,为了寻找钾通道KCNQ1的特异性多肽调节剂,本论文从大量蝎毒素多肽中,筛选了六个功能未知的酸性钾毒素,并进行了功能鉴定,发现这六个酸性钾毒素并不能有效抑制KCNQ1通道的电流。在此基础上,确定了KCNQ1通道的多肽设计方向,并初步成功地设计了T1毒素多肽(IC50为4.6±1.9μM),为进一步设计靶向KCNQ1通道的特异性多肽调节剂奠定了基础。