论文部分内容阅读
禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian Sarocma Virus，RSV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。在家禽生产中，该疾病主要引起鸡群产蛋率下降、死亡率上升、肉品质降低，同时严重影响机体免疫系统，表现出中枢免疫器官萎缩和抵抗力明显下降，继而增加其他疾病的感染几率。近年来，ALV-J作为一种主要流行的禽白血病病毒，严重危害着养殖业的健康发展，给中国乃至世界养鸡业带来了巨大的经济损失，至今还没有有效控制禽白血病的疫苗和药物。目前主要通过种群净化来控制疾病，但这种方法存在着成本高、周期长、受外界环境影响大等弊端。因此，迫切需要从遗传上探明ALV-J的感染机制以及寻找防治ALV-J的方法。本研究利用Illumina HiSeq2500高通量测序技术，分别在体内和体外水平对ALV-J感染的鸡源细胞以及病鸡组织样进行全转录组测序，筛选出病毒感染过程中的关键差异mRNA和lncRNA，探讨lncRNA在病毒感染过程中的可能作用机制，从而为寻找禽白血病的肿瘤标记物以及家禽抗病育种提供理论基础。主要研究内容如下: 1、为探讨鸡免疫细胞和体细胞感染ALV-J后病毒复制与宿主细胞生物学特性的变化，本研究利用鸡巨噬细胞(HD11)与成纤维细胞(CEF)为素材，分别接种100个TCID50的ALV-J病毒，并在1dpi、2dpi、3dpi、4dpi、5dpi、7dpi检测了细胞中的病毒拷贝数、细胞活力、细胞凋亡率三个指标。结果表明，CEF细胞中的病毒拷贝数在4dpi时显著上升(P＜0.05)，HD11细胞中病毒拷贝数在5dpi时出现显著上升(P＜0.05）;CEF细胞活力在5dpi后出现显著上升（P＜0.05），而HD11细胞则在4dpi前显著上升(P＜0.05）;两种细胞的凋亡率均是随时间延长而增加，在3dpi时达到最大，随后出现下降。 2、基于细胞生物学检测结果，我们选取了1dpi、4dpi、7dpi三个时间点，利用RNA-seq技术对两种细胞进行全转录组测序。通过对转录组数据分析，我们分别获得了336和269个差异表达基因。经过荧光定量验证后将这些差异表达基因进行功能注释分析，发现多条信号通路与免疫反应相关，如先天性免疫反应（OASL，CCL4），适应性免疫反应(LYZ,CD72），凋亡与自噬（WISP2,COMP），炎症反应(JSC,IL8），肿瘤形成相关(PCNA，GPX3）。 3、为挖掘转录组数据中的lncRNA信息，利用cuffinks等生物信息学软件对lncRNA进行了比对、预测，共获得了12103条lncRNA。通过对差异表达的lncRNA进行顺式(Cis)和反式(Trans)预测，在CEF细胞中，差异lncRNA所预测的靶基因被富集到多个与先天性免疫和炎症反应相关的通路中(ISG15-protein conjugation，innate immune response);而在HD11细胞中，多被富集到血管生成、细胞外基质等通路(negative regulation of autophagy，T cell activation)。通过IncRNA与mRNA共表达分析，发现NONGGAT007033.2，TCONS_00143593，TCONS_00286311等多个lncRNA与CNN2, MMP2, CD72, CCL4, IL-1等免疫相关基因存在显著共表达关系。 4、为了进一步探索ALV-J在机体感染中的转录组变化情况，从实际生产中筛选出只感染ALV-J与健康个体各3只，对其脾脏组织进行RNA-seq，共筛选出2104个差异表达的基因和9036条差异表达的lncRNA。对lncRNA进行Cis分析并与差异表达的mRNA进行共表达分析，筛选出12个关键lncRNA(如:TCONS_00257530，TCONS_0023449，TCONS_00273421，TCONS_00267624)与14个差异表达mRNA(如:NFATC2, IL9R，OSMR,CD34)可能存在调控关系，其具体作用机制需进一步研究。