厚壳贻贝组织-微生物生态关联及其分子响应研究

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贻贝是我国具有重要经济价值的贝类之一,也是我国第四大养殖贝类。以往研究表明,贻贝通常具有较强的环境适应能力,包括对疾病较强的耐受性,可见贻贝必然具有一套强大的先天免疫体系,保障了贻贝在富含各种微生物的海水环境中生存。目前对贻贝先天免疫系统的研究已较为深入,但是对贻贝-微生物的生态关联以及微生物对贻贝不同组织所诱导的免疫响应过程和机制仍具有较大研究空间。为深入了解贻贝在海水中如何与水体各种微生物发生相互作用,以厚壳贻贝(Mytilus coruscus)为研究对象,对厚壳贻贝不同组织中的微生物进行了种群鉴定分析,以探讨和了解贻贝不同组织中的微生物群落结构差异。通过收集厚壳贻贝不同组织样本,采用16S r DNA克隆子测序(V3-V4区)方式,在Illumina Mi Seq测序平台上对厚壳贻贝的血淋巴、消化腺、肾脏、鳃、外套膜、性腺和足等7种组织中的微生物群落进行16S rDNA测序,并在此基础上开展微生物群落结构分析及组织间微生物的多样性差异比较。结果显示,上述组织样本中平均产生36,860条高质量序列。其中,厚壳贻贝血淋巴共产生1,237个OTU,其次是消化腺(1,014个OTU)和肾脏(1,015个OTU),性腺所测得OUT数为最低最少(仅553个)。尽管血淋巴OTU数最高,但仅有9个独有OTU。而肾脏拥有172个独有OTU,其次为消化腺(144个独有OTU)。所有组织中均以变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)为主要菌群。通过Bray-Curtis相似矩阵分析发现,血淋巴、消化腺、肾脏和足的为生物群落聚成一支;而鳃、性腺和外套膜的细菌群落具有较强的相似性。Alpha多样性指数分析显示血淋巴、消化腺和肾脏微生物多样性最高。以上结果表明,厚壳贻贝不同组织的微生物群落存在较强的组织特异性,表明贻贝不同组织在微生物富集和定植方面存在差异,也表明贻贝不同组织可能对微生物具有不同的免疫响应机制。为进一步了解厚壳贻贝不同组织对不同微生物的免疫响应过程及其分子机制,以厚壳贻贝为研究对象,以其鳃组织和性腺组织为代表性组织,开展了不同微生物诱导后,鳃和性腺组织的转录组分析。考虑到厚壳贻贝组织中天然富集了大量微生物,为去除这些本底微生物对后续实验的影响,采取低浓度混合抗生素处理方式,对厚壳贻贝进行了抗生素预处理。结果表明,低浓度混合抗生素处理可有效清除贻贝组织中的微生物,且并未对其血细胞数量并未产生明显影响。对抗生素处理后的贻贝进一步采用藤黄微球菌和副溶血弧菌诱导,分别代表了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌诱导。分别在诱导后0.5和2h收集贻贝鳃和性腺组织,加上抗生素与处理组和对照组,共构建36个c DNA文库并开展了转录组测序,总计获得245.01Gb clean data,每个文库平均数据量5.91Gb且Q30>94%。经过滤后的reads初步组装得到91,850个转录本,聚类后得到59,206个unigenes。进一步的差异基因筛选分析,在厚壳贻贝鳃组织样品中总共检测到19,783个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),性腺样品中检测到12,655个差异表达基因。通过对上述差异基因的功能注释与功能富集分析,结果表明,贻贝鳃在细菌感染后表现出强烈的免疫反应,大量免疫相关信号通路被激活,表明了鳃在贻贝免疫系统中的重要作用和贻贝免疫反应的组织特异性。性腺的DEGs主要富集在与细胞生长和增殖有关的调节通路中。此外,与副溶血弧菌相比,鳃和性腺对藤黄微球菌的感染呈现快速激活,表明贻贝对革兰氏阳性菌的敏感性更高。上述贻贝研究揭示了不同组织在不同细菌感染后所产生的的不同免疫响应,从而为探讨贻贝免疫系统的作用机制提供了线索。
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