人成纤维细胞生长因子21突变体的制备及活性探究

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背景:成纤维细胞生长因子(Fibrablast Growth Factors,FGFs)属于多功能多肽生长因子家族,调节多种细胞的迁移、增殖、分化、代谢活动和神经功能。家族成员FGF21近年来被证实在增强胰岛素敏感性、调节能量稳态、逆转脂肪肝等方面表现优异,作为一种具有潜在医疗价值的代谢新靶标受到关注。但天然FGF21蛋白表达量低、活性不高、稳定性差等物化性质限制了它的实际应用。在不改变原有生物学功能的基础上对FGF21进行定点突变改造,增加蛋白表达量,提高生物活性,对FGF21蛋白及其类似物的开发应用具有重要价值。目的:运用生物学信息分析的方法解析FGF21蛋白的理化性质,利用同源模建的方式构建该蛋白的三维结构。利用密码子优化技术实现FGF21蛋白在大肠杆菌表达系统中的高效可溶表达。采用定点突变的方式构建突变载体,获得生物学活性更强的FGF21突变蛋白。方法:1.从NCBI数据库中获取核苷酸序列及氨基酸序列,利用Expasy、Predictprotein、PDB数据库对蛋白理化性质进行分析,利用Uniprot、SWISSMODEL等网站构建蛋白模型。为蛋白表达系统的选择以及突变位点的确定提供参考。2.利用密码子分析网站对Fgf21基因序列进行分析并优化,探究密码子使用情况对蛋白表达的影响。在大肠杆菌表达系统中,设计正交实验探究重组FGF21蛋白的最适条件,经镍离子亲和层析柱和重力型去盐柱对重组蛋白分离纯化。3.通过同家族、多物种间氨基酸序列比对及突变预测的方式筛选突变位点,以p ET-32a(+)-Fgf21表达载体为模板,采用定点突变的方式构建突变载体,在大肠杆菌系统表达突变蛋白,在Hep G2细胞上进行细胞促糖吸收实验,利用葡萄糖氧化酶法检测培养基中残余葡萄糖含量,通过四参数回归计算法确认FGF21突变型的生物学活性。在SWISS-MODLE建立突变型蛋白的三级结构,使用GRAMM-X进行“蛋白质-蛋白质”分子对接,对接结果使用Py MOL分析,讨论突变型蛋白促糖吸收效果强于野生型蛋白的可能原因。结果:1.Fgf21基因编码蛋白区生物学信息分析该基因显示编码209个氨基酸,分子式组成为C992H1541N273O303S5,预测的理论等电点为5.01。蛋白不稳定系数为58.57,脂肪族系数为83.59。GRAVY值为-0.334,判断为亲水性蛋白。N端存在28个信号肽残基,总体涵盖34个磷酸化位点,不含跨膜结构域与N-糖基化位点,说明该蛋白具有在大肠杆菌系统中实现表达的可能性。二级结构显示无规卷曲占比70.34%。以FGF21核心区域的溶液结构(ID:6m6e.1.A)为模板进行同源模建,拉氏图显示大部分的氨基酸残基位于最佳区域和许可区域,能够为突变位点的筛选提供依据。2.重组FGF21蛋白在大肠杆菌系统中的异源表达在Fgf21基因原始序列中使用频率低于20%的密码子接近30%。密码子优化时去除信号肽,提高密码子适应指数,同时调整GC含量及二级结构等。正交实验显示当OD600值约为0.5时,加入IPTG至终浓度0.25 m M,30℃诱导表达6小时,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中的相对表达量最高。通过镍离子亲和层析柱与重力型去盐柱获得了高纯度的目的蛋白。蛋白含量测定结果显示,密码子优化后的重组蛋白含量是优化前的2.13倍。Western Blot实验证明纯化后的蛋白能与FGF21抗体发生特异性反应。3.FGF21突变型蛋白的制备及活性分析Jalview数据显示FGF21在FGF19亚家族内同源性不高,在物种间高度保守。Predict Protein、PROVEAN、Poly Phen-2预测提示将FGF21的第58位亮氨酸(Leu)突变为缬氨酸(Val)(L58V),第108位谷氨酰胺(Gln)突变为精氨酸(Arg)(Q108R),第119位脯氨酸(Pro)突变为丝氨酸(Ser)(P119S)可能会对蛋白结构及功能产生有益影响。利用无缝克隆的方式成功构建各突变重组载体,通过16℃低温条件诱导获得了高表达量、高纯度的突变蛋白。Hep G2细胞糖吸收试验进一步显示FGF21野生型蛋白、FGF21突变型蛋白同样具有调节细胞葡萄糖代谢的作用。并且mut FGF21(L58V)、mut FGF21(Q108R)突变蛋白促进糖吸收效果随着蛋白浓度增加,剂量依赖效应更加明显。经四参数回归计算法拟合,mut FGF21(L58V)、mut FGF21(Q108R)突变型蛋白的生物学活性分别为23.22 U/g,21.97 U/g,蛋白活力相当于FGF21野生型蛋白的1.687倍,1.596倍。结论:1.基于密码子优化策略的人源FGF21蛋白异源表达成功,优化后的表达量是优化前的2.13倍;2.通过定点突变,获得了生物学活性更好的mut FGF21(L58V)、mut FGF21(Q108R)突变蛋白,为进一步研究开发奠定基础。
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