研究目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据报道,在世界范围内,每年新增1400,000例女性乳腺癌患者,并有约500,000例患者死于乳腺癌。在我国,每年被诊断为乳腺癌和死于乳腺癌的人数也在逐年增加。因此,阐明调控乳腺癌的分子生物学机制,寻求新型治疗手段已成为目前临床工作者重要的转化医学研究之一。在我国,槐耳作为一种药用真菌,已有了1600多年的历史。近年来,槐耳在肿瘤防治方面的作用引起了越来越多的关注。有研究表明,槐耳对肝癌、胆管癌、卵巢癌、黑色素瘤、结直肠癌、胃癌、宫颈癌、肺癌、纤维肉瘤等多种肿瘤均具有显著的抑制作用。我们之前研究结果也表明,槐耳可以抑制乳腺癌细胞的增殖和浸润转移。然而,槐耳抑制乳腺癌的分子生物学机制仍未完全明了。因此,在本研究中,我们拟从自噬、增殖、雌激素受体信号通路、肿瘤干细胞特性和血管新生等5个方面,利用分子生物学技术,并结合临床病理标本,全面阐述槐耳对乳腺癌的抑制作用,为槐耳的临床应用提供药理学依据,为乳腺癌的综合治疗提供参考。研究方法及结果：在本研究中,我们拟进一步探讨槐耳对乳腺癌的抑制作用,具体内容包括以下5个方面：第一部分槐耳诱导乳腺癌细胞自噬研究方法：我们利用MTT实验检测槐耳对乳腺癌细胞增殖能力的影响。通过AO/EB染色和TUNEL法对槐耳诱导的细胞死亡方式进行检测。随后,我们利用透射电镜、MDC染色、免疫荧光、western blot和流式细胞仪检测槐耳对自噬的诱导作用。为了进一步探讨槐耳诱导的自噬对细胞的影响,我们选用了自噬抑制剂以及针对LC3B的siRNA,并利用MTT检测抑制自噬后对槐耳抑癌作用的影响。利用western blot检测槐耳对自噬相关信号通路的影响。随后,我们利用裸鼠皮下成瘤模型,研究槐耳对体内移植瘤的作用,并应用免疫组化染色和western blot检测自噬相关通路的变化。研究结果：槐耳可以显著抑制MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF7等三个细胞系的增殖。AO/EB染色和TUNEL法表明槐耳可以引起细胞的坏死和凋亡。利用透射电镜和MDC染色,我们发现槐耳可诱导细胞出现自噬小体。免疫荧光和western blot实验表明槐耳可以增加LC3B的表达量。同时,流式细胞仪证实槐耳处理后乳腺癌细胞体内酸性自噬滤泡的含量升高。干扰自噬可显著抑制槐耳对细胞的杀伤能力。Western blot的结果表明,槐耳可显著增强AMPK的活性,并抑制mTOR/S6K通路的激活。另外,体内实验表明,槐耳可显著抑制乳腺癌皮下移植瘤的生长,增加LC3B、Atg7和Beclin-1的表达,降低p62/SQSTM1的表达。第二部分槐耳通过调控miR-99a-HOXA1通路抑制乳腺癌的增殖研究方法：我们首先利用qPCR技术检测了槐耳对HOXA1表达量的影响。为进一步了解HOXA1的分子生物学功能,我们向乳腺癌细胞中转染了siHOXA1,并通过qPCR实验检测了转染效率。MTT和transwell小室实验分别检测了HOXA1对乳腺癌增殖、迁移和侵袭能力的影响。随后,我们观察了过表达HOXA1后对槐耳抑癌作用的影响为探索槐耳抑制HOXA1的分子生物学机制,我们利用miRNA表达谱芯片寻找槐耳的靶标miRNA。利用qPCR实验检测槐耳对miR-99a水平的影响。MTT和transwell小室实验分别检测了miR-99a对乳腺癌增殖、迁移和侵袭能力的影响并通过双荧光素酶报告基因实验确定miR-99a与HOXA1基因的靶向关系。为进一步明确恢复HOXA1的表达是否能够逆转miR-99a所诱导的肿瘤抑制作用,我们将3’UTR区缺失的HOXA1过表达载体或空载体分别转染至MCF7-miR-99a和MCF7-PMSCV细胞中,并通过MTT和transwell、室实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变。研究结果：我们利用实时定量PCR技术发现槐耳可以抑制HOXA1的表达。干扰HOXA1的表达后,细胞的增殖,迁移和侵袭能力均受到明显抑制。过表达HOXA1后能够逆转槐耳的肿瘤抑制作用。miRNA表达谱芯片显示,槐耳可以抑制miR-99a的表达。相比于31例正常乳腺组织样本,110例原发乳腺癌组织标本中miR-99a的表达量明显下调(P=0.0031)。此外,84%(26/31)的乳腺癌患者的癌组织中miR-99a的表达量也低于周围正常组织。同时,在miR-99a表达量较低的患者中,患者的生存期更短(P=0.040),且更易发生转移。过表达miR-99a后,细胞的增殖、迁移和侵袭能力更强。下调miR-99a的表达,结果则相反。利用生物信息学的方法分析,我们发现HOXA1为miR-99a的潜在作用靶点。Western blot实验证实,miR-99a能够显著抑制HOXA1的蛋白水平。双荧光素酶报告基因实验表明HOXA1是miR-99a的直接作用靶点。过表达HOXA1后能够逆转miR-99a的肿瘤抑制作用第三部分槐耳抑制乳腺癌细胞的雌激素受体α信号通路研究方法：我们利用MTT实验验证槐耳对ER α阳性乳腺癌细胞系增殖的影响。通过qPCR和western blot实验分别检测槐耳对ERα mRNA和蛋白水平的影响。为了研究槐耳介导ER α降解的分子机制,我们使用了MG132蛋白酶体抑制剂。随后我们利用qPCR,进一步研究槐耳对ERα下游靶基因的影响。并利用MTT和western blot实验,探究槐耳对雌激素诱导的细胞增殖以及NF-κB通路的影响。研究结果：槐耳可以显著抑制三种ER α阳性乳腺癌细胞系的增殖(P<0.05),抑制作用呈时间和剂量依赖性。同时槐耳可以降低乳腺癌细胞中ER α的mRNA和蛋白水平。MG132可显著抑制ER α的降解(P<0.05)。同时,槐耳可以降低CathepsinD,pS2以及PR的mRNA水平,并呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。雌激素诱导的细胞增殖可被槐耳显著抑制,这一现象与槐耳抑制NF-κB通路有关。第四部分槐耳抑制乳腺癌的干细胞特性研究方法：我们利用MTT实验检测槐耳对乳腺癌悬浮细胞球中细胞活性的影响,并观察悬浮细胞球体积和数量的变化。克隆形成实验检测槐耳对乳腺癌克隆形成能力的影响。流式细胞学实验检测槐耳对CD44+/CD24-细胞的影响,并利用qPCR分析槐耳对肿瘤干细胞标记物的改变。为深入探究槐耳抗肿瘤干细胞的分子作用机制,我们运用western blot实验对肿瘤干细胞相关信号通路进行检测。研究结果：MTT的结果表明,槐耳能够抑制MCF7悬浮细胞球的细胞活性。同时,槐耳可以降低悬浮细胞球的数目和大小。在克隆形成实验中,我们发现槐耳可显著降低乳腺癌的克隆形成能力,并降低holoclone型细胞克隆的百分比。流式细胞学实验表明,槐耳能显著减少CD44+/CD24-细胞的数目,与对照组相比,CD44 +/CD24-的细胞百分比分别下降了50.23% Q mg/ml),61.36% (4mg/ml)和62.73%(8 mg/ml)。OCT-4,NESTIN和Nanog等肿瘤干细胞标记物的mRNA水平也显著降低,并呈时间和剂量依赖性。通过western blot实验,我们发现槐耳能显著抑制hedgehog通路的激活。第五部分槐耳抑制乳腺癌的血管新生能力研究方法：利用MTT实验,我们检测了槐耳对HUVEC细胞活性的影响。为了进一步研究槐耳抗HUVEC细胞增殖的分子机制,我们应用流式细胞仪研究细胞凋亡和细胞周期的分布情况。划痕和transwell小室实验检测槐耳对乳腺癌迁移和侵袭能力的影响。利用血管形成、CAM和主动脉环实验,检测槐耳对体内外血管新生能力的影响。为了研究槐耳的作用机制,western blot实验对血管新生相关信号通路进行了检测。随后我们将鼠源性乳腺癌细胞4T1种植在裸鼠皮下,检测槐耳的体内抗肿瘤和抗血管新生作用。研究结果：MTT结果表明,槐耳可抑制HUVEC细胞的增殖。经流式细胞仪检测,槐耳可诱导HUVEC细胞的凋亡,并将细胞阻滞在G0/G1期。划痕实验和transwell小室实验证实,经槐耳处理后,HUVEC的迁移和侵袭能力受到显著抑制,并呈时间和剂量依赖性(P<0.01)。血管形成实验、CAM实验和主动脉环实验的结果表明,槐耳可显著抑制血管新生,这种抑制作用与VEGF的降低,以及槐耳对ERK、JNK、 STAT3和NFkB等通路的抑制有关。同时,槐耳可抑制体内移植瘤的生长,并降低瘤内的微血管密度。结论：1.槐耳通过抑制mTOR/S6K信号通路诱导细胞自噬2.槐耳通过miR-99a-HOXA1通路抑制乳腺癌的增殖3.槐耳能够抑制乳腺癌细胞中的雌激素受体α信号通路4.槐耳通过hedgehog通路抑制乳腺癌的干细胞特性5.槐耳能够抑制乳腺癌的血管新生能力意义：本研究从自噬、增殖、雌激素受体信号通路、肿瘤干细胞特性和血管新生等5个方面揭示了槐耳的抗肿瘤作用及其分子生物学机制。这些结果证实了槐耳在治疗乳腺癌中的重要作用,并为其在临床治疗中的应用提供了理论依据。