研究背景白血病是由克隆中的多能干细胞或更早期的祖细胞基因突变产生,而停滞在细胞不同的发育阶段,白血病细胞在骨髓和机体其他造血组织中大量增生并浸润其他器官和组织,以致正常造血功能受抑制,是一类造血系统异常的恶性疾病。目前我国白血病的发病率大约为4-5/10万,在所有恶性肿瘤所致的死亡率中,男性白血病发病率居第六位而女性居第八位。但是在儿童及35岁以下成人中白血病发病率居第一位,是导致青少年死亡的首要疾病。急性髓细胞白血病是成人白血病的主要类型,大约占成人各种白血病的60%,死亡率较高。虽然近年来治疗方法有了很大改进,急性白血病的完全缓解率、生存率较前有明显的提高,但15%-25%患者因为药物抵抗仍不能获得完全缓解,并且40%的完全缓解患者在两年内复发。白血病干细胞位于细胞克隆起始阶段,具有跟正常干细胞一样自我更新能力和分化潜能,但却丧失正常干细胞的自我调控能力,被认为是白血病发生的根源,其可以抵抗常规的化疗和放射治疗,又是白血病复发和转移的种子细胞。只有消除白血病干细胞才能提高白血病治愈率,降低复发率,以白血病干细胞为靶的治疗正在成为治疗的新定位。KGla细胞株是从一男性急性髓系白血病患者体内获得,此细胞株对粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子无反应,研究发现其高表达CD34抗原,部分缺失CD38抗原,白血病干细胞具有CD34+CD38表型特性,由此可见,CD34+CD38-KG1a细胞是一种具有白血病干细胞表型的细胞株,可以应用于对白血病干细胞的研究。具有CD34+CD38表型的KGla细胞对化疗药物耐药并抵抗自然杀伤细胞杀伤作用。因此,本研究拟以处于分化早期阶段的急性髓系白血病KGla细胞作为研究的靶细胞。吉西他滨(gemcitabine, GEM)结构为2’-脱氧-2’,2’-盐酸二氟胞苷(β2异构体),在结构上与阿糖胞苷(Cytarabine, Ara-C)相似,系阿糖胞苷2’-碳上的氢和羟基被双氟取代,是一种新型嘧啶类核苷酸抗代谢肿瘤药物,并且还属于细胞周期特异性抗癌药。其主要作用于细胞S期,也可以阻止G1期细胞向S期的进展,以此来影响细胞周期重分布,使周期敏感细胞成分增加。现已证实该药目前广泛应用于非小细胞肺癌、胰腺癌和乳腺癌等实体瘤治疗。GEM在恶性血液系统疾病方面的应用,国外开展了GEM治疗难治性淋巴瘤及多发性骨髓瘤的临床试验,均取得较好的疗效。而应用于白血病的治疗仅限于基础研究阶段。目前生物免疫治疗是继手术、化疗、放疗之后的一种新型治疗方法。免疫治疗具有抗原识别的靶向性和时空效应性,是以白血病干细胞为靶的治疗的根据。固有免疫效应细胞治疗属于生物治疗的一种,其作用机制与化学治疗不同,不存在耐药性问题。自然杀伤(natural kill, NK)细胞是固有免疫的主要效应细胞,具有免疫监视作用,可以清除HLA缺失的肿瘤细胞,决定肿瘤细胞被免疫效应细胞杀伤敏感性主要来自HLA-KIR的错配程度和活化性配体NKG2D (MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表达水平。静息状态NK细胞受到肿瘤细胞表面NKG2D配体激活,具有杀伤功能,在体外激活后可直接输注应用。通常白血病干细胞处于静息状态,内外源凋亡系统处于关闭状态,表面免疫激活分子低表达。研究显示,多酚类植物单体能分别激活白血病、淋巴瘤肿瘤干细胞表达MICA/B或ULBP分子,激活NK细胞；可调节CSC外源性凋亡受体DR、DcR、casapse-8的表达,使其成为杀伤敏感细胞。不同的细胞因子可以促进NK细胞增殖,而GEM是否能调节具有白血病干细胞特性的CD34+CD38早期急性髓系白血病KGla细胞被机体免疫细胞对其的杀伤敏感性呢?将是本实验研究的重点。因此,本实验以具有白血病干细胞特性的CD34+CD38早期急性髓系白血病KGla细胞为靶细胞,通过细胞克隆形成实验来研究CD34+CD38-KGla细胞的分化发育阶段及自我更新能力。采用GEM为干预手段,并与阿糖胞苷作为对比,以细胞克隆,细胞周期,细胞凋亡等指标,观察GEM对CD34+CD38-KGla细胞的生物学特性的影响以及研究GEM是否能调节CD34+CD38-KGla细胞被外周血单个核细胞杀伤的敏感性,从而为GEM体外对抗白血病提供实验室依据。了解GEM是否具有增强KG1a细胞被PBMC杀伤敏感性,为新的免疫治疗方案提供新思路。第一部分吉西他滨对CD34+CD38-髓系白血病干细胞的生物学效应[目的]通过检测干细胞表型、软琼脂克隆形成率检测CD34+CD38-KGla细胞分化发育阶段及自我更新能力,采用GEM为干预手段,以细胞凋亡、细胞周期、克隆形成为检测指标,观察GEM对CD34+CD38-KGla细胞的生物学效应的影响。[方法]流式细胞仪检测(Flow cytometry, FCM) KGla细胞表面CD34和CD38抗原表达水平;软琼脂半固体培养基集落形成法检测CD34+CD38-KGla细胞克隆形成率及GEM对KG1a细胞克隆形成率的影响；通过台盼蓝拒染法观察不同浓度的GEM(0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L)和阿糖胞苷分别在24h、48h、72h对KG1a细胞的增殖影响；利用流式细胞仪检测各浓度GEM (0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L)和阿糖胞苷作用24h后对KGla细胞周期变化的影响；流式细胞仪AnnexinV-FITC法检测不同浓度的GEM (0.05mg/L、0.1mg/L.0.5mg/L)和阿糖胞苷作用24h后对KG1a细胞诱导凋亡的影响。[统计学方法]数据以均数±标准差(mean±SD)表示,应用SPSS13.0软件处理数据,多组间均数比较采用析因设计资料的方差分析,两组均数比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。[结果]急性髓系白血病KGla细胞中表型为CD34+CD38-KG1a细胞占(98.02±0.72)%。软琼脂培养按每孔2500个KG1a细胞,第14d、21d克隆形成率分别为(21.52±1.75)%和(23.97±0.64)%,说明实验用KG1a细胞具有白血病干细胞表型及自我更新能力特性。0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L的GEM分别作用KG1a细胞24d、48d、72d后,增殖抑制呈现时间和剂量依赖,抑制作用明显强于同浓度同时间阿糖胞苷组(P<0.05)。0.5mg/L GEM作用KG1a细胞24小时后有(20.70±3.24)%的KG1a细胞发生凋亡或坏死,显著高于盐水对照组(7.59±1.80)%和阿糖胞苷组(14.22±1.41)%(P<0.05)。而0.05mg/L、0.1mg/L GEM作用KG1a细胞后其凋亡率与盐水对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L GEM作用KG1a细胞24h后,软琼脂培养第14d,0.1mg/L和0.5mg/L组形成的克隆率分别为(15.06±1.15)%和(3.75±0.38)%,低于对照组(21.52±1.75)%(P<0.05),第21d克隆率为(15.61±1.08)%和(3.91±0.32)%,低于对照组(23.97±0.64)%(P<0.05),0.05mg/L GEM组14d、21d的克隆数分别为(20.28±1.11)%、(18.23±15.73)%,与对照组(21.52±1.75)%和(23.97±0.64)%相比,差异无统计学意义(P>0.05)。0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L GEM和阿糖胞苷持续作用组,按每孔2500个,软琼脂培养14d和21d均未见集落生长,与对照组(21.52±1.75)%和(23.97±0.64)%相比差异具有统计学意义(P<0.05)。说明GEM抑制KG1a细胞克隆形成并呈现时间和剂量依赖。0.5mg/L GEM作用KG1a细胞24d后存活率为(22.93±5.73)%,存活的KG1a细胞中(88.10±1.97)%细胞处于G0/G1期,较盐水对照组(52.2±7.18)%增加35.9%(P<0.05),S期、G：/M期较对照组分别减少31.9%、4.6%(P<0.05),而0.05mg/L和0.1mg/L GEM作用KG1a细胞24d后,G0/G1期细胞与盐水对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。[小结]1.本实验所用KG1a细胞具有干细胞表型及生物特性。2.不同浓度GEM具有抑制CD34+CD38-KG1a细胞增殖作用,并具有剂量时间依赖性,且抑制作用优于同浓度同时间组阿糖胞苷组。3.浓度为0.5mg/L的GEM可将CD34+CD38-KG1a细胞阻滞在G,/G0期。4.GEM对CD34+CD38-KG1a细胞具有早、晚期凋亡作用,诱导凋亡作用优于同浓度阿糖胞苷组。5.GEM显著抑制CD34+CD38-KG1a细胞的克隆形成能力,抑制CD34+CD38-KG1a细胞的自我更新和增殖潜能,同时持续平稳的药物浓度增强其抑制效应,抑制作用均强于同浓度阿糖胞苷组。6.GEM对CD34+CD38-KG1a细胞增殖能力及克隆能力的抑制可能与其使CD34+D38-KGla细胞产生G1/G0期周期阻滞和具有早、晚期凋亡作用有关。第二部分吉西他滨对CD34+CD38-KG1a细胞被外周血单个核细胞杀伤的敏感性影响[目的]探讨GEM作用前后CD34+CD38-KG1a细胞被未活化人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)和IL-2、IL-15活化的PBMC杀伤的敏感性影响。[方法]通过台盼蓝拒染法观察不同浓度的GEM (0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L)对KGla细胞及PBMC的增殖抑制作用；LDH检测0.1mg/L GEM作用48h后对CD34+CD38-KGla细胞被IL-2、IL-15活化前后PBMC杀伤的敏感性影响；流式细胞仪检测0.1mg/L GEM作用48h后CD34+CD38-KG1a细胞表面NKG2D配体(MICA、 MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表达率。[统计学方法]数据以均数±标准差(mean±SD)表示,应用SPSS13.0软件处理数据,多组间均数比较采用析因设计资料的方差分析,两组均数比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。[结果]在浓度为0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L GEM作用下,随着GEM浓度的递增和作用时间延长,其对单个核细胞无增殖亦无毒性作用,差异无统计学意义(P>0.05)。未经IL-2、IL-15活化的PBMC在效靶比为10：1、20：1时,KGla细胞被PBMC的杀伤率为(4.87±0.99)%和(6.31±0.46)%,经GEM作用48h后KG1a细胞被未经活化PBMC的杀伤率为(17.88±3.76)%和(36.60±4.27)%,分别增高了13.01%、30.29%((P<O.05)。同等条件下,经IL-2、IL-15活化的PBMC在效靶比为10：1、20：1时,未经GEM处理的KG1a细胞在被IL-2、IL-15活化后的PBMC的杀伤率分别为(25.63±2.95)%和(36.14±4.84)%,而经GEM作用后的KG1a细胞被IL-2、IL-15活化后的PBMC杀伤率则为(35.30±4.99)%和(53.74±7.74)%,分别增高9.67%,17.6%(P<0.05)。实验结果显示,GEM能明显提高KG1a细胞被活化前后PBMC杀伤的杀伤率(P<0.05),且经过IL-2、IL-15活化的PBMC细胞杀伤效应明显优于未经活化的PBMC(P<0.05)。GEM作用48h后检测KG1a细胞表面NKG2D的配体(MICA, MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)表达与作用前相比差异无统计学意义(P>0.05)。[小结]1、不同浓度GEM对PBMC增殖无明显影响。2、IL-2、IL-15活化后的PBMC细胞杀伤效应明显高于未活化的PBMC。3、GEM能增强KG1a细胞被PBMC的杀伤敏感性。[结论]1、GEM对KG1a细胞具有周期阻滞、部分诱导凋亡,增殖抑制、抑制克隆形成的生物学效应。2、GEM对PBMC增殖无明显影响。3、GEM能增强KG1a细胞被PBMC杀伤敏感性。4、本实验为GEM联合PBMC组成过继性免疫化疗方案应用于临床髓系白血病治疗提供实验依据。