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研究目的:胸腺瘤是最常见的前纵隔肿瘤,常合并重症肌无力(MG)等多种自身免疫性疾病,但胸腺瘤引起MG的发病机制尚不完全清晰。目前的研究认为,Th17细胞及Treg细胞在诱导中枢及外周免疫耐受中起着重要的作用,Th17与Treg表达失衡也是近年来包括MG在内的很多自身免疫性疾病的研究热点。所以本研究拟通过对合并或不合并MG的胸腺瘤患者外周血及胸腺瘤组织的实验,证明合并MG的胸腺瘤患者外周血及胸腺瘤组织中存在Th17/Treg比例失衡,同时外周血中存在IL-6/TGF-β比例升高,胸腺瘤组织中存在RORγt mRNA和蛋白的表达升高,Foxp3 mRNA和蛋白的表达降低,通过体外实验证明胸腺瘤细胞系可以改变健康人淋巴细胞中Th17、Treg亚群比例,其机制是胸腺瘤细胞系可以分泌大量的IL-6、抑制TGF-β。希望我们的研究能够进一步确立胸腺瘤中Th17/Treg表达失衡与重症肌无力的发病关系及可能的机制。研究方法:(1)单纯胸腺瘤、胸腺瘤合并MG患者各30例,分析临床资料及免疫检测指标,手术前抽取外周血15ml,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,经刺激、破膜后,流式细胞仪检测Th17和Treg细胞在PBMC中的比例,使用ELISA法检测血清中IL-6、TGF-β的含量;(2)单纯胸腺瘤、胸腺瘤合并MG患者各30例,术中取胸腺瘤组织,石蜡包埋、制片,通过免疫组织化学双染的方法检测胸腺瘤中Th17细胞(以CD4+、IL17+标记)、Treg细胞(以CD4+、FoxP3+标记)的含量,免疫组化、RT-qPCR的方法检测胸腺瘤组织中RORγt、Foxp3蛋白或mRNA的表达情况;(3)通过ELISA法检测胸腺瘤细胞系Thy0517第0至5日培养液上清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-12、IL-21、IL-23和TGF-β7个细胞因子的表达。MACS微珠法分离健康人外周血中CD4+T淋巴细胞,与胸腺瘤细胞系Thy0517共培养3天,流式细胞法检测培养后Th17细胞和Treg细胞的比例,研究Thy0517对CD4+T细胞分化的影响。研究结果:(1)胸腺瘤合并MG患者与单纯胸腺瘤比较,IgE明显升高,C3及CRP明显降低,其余免疫指标和CD4+T细胞、CD8+T细胞在两组中无明显差异。(2)相对单纯胸腺瘤患者,合并MG的胸腺瘤患者外周血中Th17比例升高(2.02±1.22%vs 3.80±2.00%,P=0.006),Treg细胞比例降低(5.90±2.21%vs 4.14±1.28%,P=0.015),二者之比明显升高(P=0.023)。血清中IL-6含量明显升高(20.32±7.40 pg/ml vs 101.10±20.3 pg/m,P=0.01),而TGF-β的含量无明显变化(P=0.07),二者之比明显升高(P<0.001)。(3)合并MG患者的胸腺瘤组织中Th17细胞数较单纯胸腺瘤明显升高(9.77±3.86 vs 4.93±2.13,P<0.0001),而Tregs细胞数明显低于单纯胸腺瘤(6.77±2.94 vs 9.93±4.40,P=0.002)。Th17/Tregs的比值在两组患者中差异更大,合并MG的胸腺瘤组织内二者比例更高(P<0.001)。(4)合并MG患者的胸腺瘤组织中RORγt蛋白含量及mRNA的相对表达量明显高于单纯胸腺瘤组(P<0.05),FoxP3蛋白含量及mRNA的相对表达量明显低于单纯胸腺瘤组(P<0.05)。(5)胸腺瘤细胞系Thy0517具有外分泌功能,在细胞培养上清中可以检测出IL-6和IL-21的表达升高,TGF-β的表达降低,而IL-1β、IL-4、IL-23变化不明显。(6)胸腺瘤细胞系Thy0517与人CD4+T淋巴细胞共培养后,Th17细胞的比例增加(0.66±0.07 vs 1.14±0.08,P<0.01),Treg细胞受抑制(3.10±0.22 vs 2.41±0.39,P<0.01)。研究结论:胸腺瘤合并MG患者外周血中和胸腺瘤组织中均存在Th17细胞比例升高、Treg细胞比例下降,同时血清中IL-6含量升高及IL-6/TGF-β降低,胸腺瘤组织中转录因子RORγt和FoxP3的基因和蛋白表达呈现类似结果。胸腺瘤细胞系Thy0517可以分泌IL-6和IL-21,抑制TGF-β,具有促进Th17细胞分化、抑制Treg细胞分化的功能。以上结果说明,胸腺瘤可引起细胞因子IL-6、TGF-β及转录因子RORγt和Foxp3的表达异常,进而影响Th细胞的分化,使Th17/Treg细胞表达失衡,引起MG发生。该研究结果提示Th17、Treg的表达水平及相对比例可能成为今后诊断或监测胸腺瘤是否合并MG的一个临床指标,为今后基于调控Th17/Treg细胞表达的免疫治疗奠定理论基础。