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Follistatin (FS，卵泡抑素 ) 在机体内主要以二种形式存在，即288氨基酸残基组成的FS-288形式及315氨基酸残基组成的FS-315形式，具有抑制垂体前叶腺细胞分泌促性腺激素(FSH)、特异性结合激活素等作用。为了探讨FS在相关疾病诊断及治疗方面的作用，本研究制备了抗FS315 C末端多克隆抗体，并在本室已制备的抗FS N末端单克隆抗体基础上，建立了FS315双位点ELISA检测法，并且对正常及患者血清中FS315水平进行了检测。具体研究内容如下。1．重组人FS-315 C末端肽融合蛋白原核表达载体构建（1）钓取编码人FS-315C末端肽的cDNA：提取人新鲜卵巢组织总RNA，用Takara一步法试剂盒扩增FS-315C末端cDNA，采用DE81纤维素法回收特异性PCR产物。（2）TA克隆：将PCR扩增的FS-315C目的基因片段与pGEM-T质粒进行TA克隆连接，取连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，采用蓝白筛选的方法筛选阳性克隆。（3）TA克隆阳性重组质粒的鉴定：碱裂解法提取质粒，鉴定含有目的基因片断的阳性质粒，Applied Biosystems 100 Model 377型DNA序列自动分析仪测定目的基因序列，所克隆的FS-315C末端基因核苷酸顺序与Gene Bank所载一致，命名质粒为pGEM-FS-315C。（4）原核表达质粒pGEX-FS-315C的构建及鉴定：通过EcoRⅠ和XholⅠ双酶切，将pGEM-FS-315C中目的基因片段定向插入GST融合蛋白表达载体pGEX4T-1中。电转化感受态大肠杆菌DH5α，质粒抽提及酶切鉴定，结果与预计一致，再经5’端上游引物测序，选取序列正确的pGEX-FS-315C克隆。2．GST-FS融合蛋白的诱导表达及产物的SDS-PAGE鉴定：（1）GST-FS融合蛋白的诱导表达及鉴定：表达质粒pGEM-FS-315C <WP=47>电转化E.coli BL21，IPTG诱导蛋白表达，超声波破碎菌体，离心后取上清，上清含有分泌型GST-FS融合蛋白。用10%SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况，GST-FS融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的20-30%。（2）GST-FS融合蛋白的纯化：Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱纯化表达的GST-FS-315C融合蛋白，按试剂盒说明书进行，纯化的GST-FS-315C融合蛋白再经电泳纯化，最终获得重组GST-FS-315C。FS315双位点ELISA检测法的建立（1）抗人FS-315C末端多克隆抗体的制备：用纯化的GST-FS315C免疫家兔，获得抗FS抗血清，抗血清经硫胺沉淀、ProteinA亲和层析纯化，获得抗FSC末端多克隆抗体。( 2 ) 双位点酶联免疫吸附试验（ELISA）检测人FS315：采用抗人FS N末端单克隆抗体（本研究室制备）包被酶标板，抗人FS-315C末端多克隆抗体为检测抗体，建立FS315双位点ELISA检测法；并利用该法分析了多种生物样本中的免疫反应性FS（Ir-FS），其结果在正常人血清、卵泡液、羊水以及小细胞肺癌培养上清中均检测到了FS315。实验同时采用IRMA检测法对上述多种样本中的FS水平进行了分析，采用ELISA和IRMA检测血清和羊水中FS水平，结果显示二者检测结果高度一致（r=0.90和0.92）；卵泡液和培养上清中的FS水平采用ELISA和IRMA检测的结果也极其相近，二者检测结果高度一致（r=0.92和0.95）。上述资料表明，本研究建立的FS315双位点ELISA检测法，适用于多种样本中的FS315水平测定。该ELISA检测样本中follistatin灵敏度为0.25ng/ml，未见与rh-Activin、Inhibin、ACTH、CRF、FSH和LH有交叉反应。实验结果表明所建立的双位点ELISA法是一种简便、快速、稳定、高敏感度及特异性的follistatin检测系统，可用于血清、羊水及卵泡液等多种生物样本中的FS检测。4．成年人外周血FS水平的随龄变化正常体检的健康成年人按年龄分组，ELISA法检测血中FS水平，同 <WP=48>时采用放射免疫分析方法(RIA)测定血中激活素A水平变化。结果显示健康成年人血清FS315水平随年龄呈正相关增加趋势，与激活素A的变化一致。5．孕期女性外周血FS水平变化采用建立的ELISA方法测定了64例正常妊娠女性血中FS水平变化情况，同时采用放射免疫分析方法测定了这些孕期女性血中的ActivinA水平变化。结果显示妇女怀孕期血清中follistatin及ActivinA水平随孕龄增加而增加。6．ELISA法检测部分患者血清中FS水平应用ELISA法检测部分患者血中follistatin水平，结果显示如慢性肝肾疾病以及血液的恶性肿瘤患者外周血FS水平升高。上述资料显示本次建立的FS315双位点ELISA法适合多种生物样本中的FS315水平测定，研究结果显示FS315及激活素A随年龄呈正相关变化，在孕期女性血中随孕龄增加而增高，可能与胎儿的发育成熟有关。该研究还显示FS315水平变化可能与机体疾病有关，如在慢性肝肾疾病时FS水平升高。