【摘 要】
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目的:构建癌-睾丸基因SSX1的原核表达载体,探索表达MBP-SSX1融合蛋白的最佳诱导条件,表达并初步纯化MBP-SSX1融合蛋白,为下一阶段研究做准备。方法:以肝细胞癌组织为材料,RT-
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目的:构建癌-睾丸基因SSX1的原核表达载体,探索表达MBP-SSX1融合蛋白的最佳诱导条件,表达并初步纯化MBP-SSX1融合蛋白,为下一阶段研究做准备。方法:以肝细胞癌组织为材料,RT-PCR扩增SSX1基因,将SSX1基因和pMAL-C2质粒均进行BamH I和Hind III酶切,连接构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α,进行蓝白斑筛选,最后酶切和测序鉴定重组质粒。将鉴定正确的重组质粒转化Rosetta菌,分别采用不同的IPTG加入时机、终浓度、诱导时间、诱导温度对Rosetta菌进行诱导,以探索表达融合蛋白的最佳诱导条件。用Amylose树脂亲和层析柱对表达的融合蛋白进行纯化,再用Factor Xa蛋白酶对其酶切,获得目的蛋白,最后采用质谱分析法鉴定目的蛋白。结果:酶切鉴定和测序鉴定显示SSX1基因与pMAL-C2质粒正确地连接。确定诱导表达MBP-SSX1融合蛋白的最佳条件为:37℃震荡培养3小时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,30℃继续震荡培养3小时;酶切融合蛋白得到的目的产物经质谱分析法鉴定为SSX1蛋白。结论:成功构建了癌-睾丸基因SSX1的原核表达载体,确定了诱导表达MBP-SSX1融合蛋白的最佳条件,表达并初步纯化了MBP-SSX1融合蛋白。
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