bta-miR-27a-3p靶向INSR在围产期奶牛脂肪肝发病中的作用研究

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhangwang198
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脂肪肝是奶牛围产期常发的一种营养代谢性疾病,其发病原因主要与脂肪过度动员、胰岛素抵抗(IR)等相关。胰岛素通过与细胞膜上的胰岛素受体(INSR)结合后引发级联反应,发挥其生物学作用。已有研究表明,IR可能是奶牛脂肪肝发病过程中的中心环节。因此,深入研究INSR及胰岛素信号通路在脂肪肝奶牛糖脂代谢中的作用机制对防治奶牛脂肪肝尤为重要。miRNA可以通过分解靶基因的m RNA或阻碍m RNA翻译来调控基因表达。人医和小鼠上的研究发现,miR-27a-3p参与了肝细胞葡萄糖摄取利用、甘油三酯(TG)合成等糖脂代谢过程。但是截至目前,鲜有文献报道miR-27a-3p在奶牛肝细胞糖脂代谢中的生物学功能。因此,本试验拟通过体内试验和体外试验相结合的方法,探究miR-27a-3p及其靶基因在奶牛肝脏糖脂代谢中的调控作用,以期从内源性调控角度部分揭示奶牛脂肪肝的分子发病机制。在体内试验中,对脂肪肝奶牛进行了血液生化指标检测和肝组织样本TG含量检测,测定了肝组织内INSR和PI3K-AKT胰岛素信号通路关键基因表达量,同时检测了与INSR基因密切联系的miRNA表达量。在体外试验中,通过向奶牛肝细胞中分别转染miR-27a-3p模拟物和抑制剂来达到miR-27a-3p在细胞水平的过表达和抑制,利用q RT-PCR和Western blot技术检测INSR及PI3K-AKT胰岛素信号通路相关基因的表达变化,并借助双荧光素酶报告基因分析进行靶向关系验证;然后使用油酸钠建立脂肪肝细胞模型,观察miR-27a-3p inhibitor是否可以抵抗油酸钠对肝细胞造成的损伤;最后向奶牛肝细胞中转染INSR的si RNA并检验下游信号通路的活性。主要试验结果如下:(1)脂肪肝奶牛体内发生了糖脂代谢紊乱,肝脏内INSR表达减少,p-PI3K蛋白表达显著下降(P<0.05),抑制糖原合成的糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)基因活性上升,水解脂质的激素敏感性脂肪酶(HSL)活化形式增多。同时,脂肪肝奶牛肝内miR-27a-3p表达显著升高且具有统计学意义(P<0.05)。结果表明奶牛发生脂肪肝时,PI3K-AKT胰岛素信号通路传导受损,且该过程可能与miR-27a-3p的调控有关。(2)过表达miR-27a-3p显著降低INSR表达量(P<0.05),抑制PI3K-AKT胰岛素信号通路,使GSK-3β基因活性上升,p-HSL的蛋白丰度增加,造成肝细胞内胰岛素敏感性下降,糖原合成减少,脂质分解加强;相反,抑制miR-27a-3p明显提高INSR表达量(P<0.05),改善PI3K-AKT胰岛素信号通路受损情况,抑制GSK-3β和HSL活性,促进肝糖原合成,减少脂质动员,有利于维护肝细胞糖脂代谢稳定。经双荧光素酶报告基因分析发现,INSR的3’UTR能够被miR-27a-3p直接靶向并起到显著调控作用(P<0.001),表明INSR为miR-27a-3p的靶基因。(3)不同浓度的油酸钠(0,0.25,0.50和1.00 mmol/L)处理奶牛肝细胞24 h。油红O染色结果显示,油酸钠浓度为0.50 mmol/L时,肝细胞出现明显脂质沉积,且细胞状态良好。另外,与油酸钠单独处理组相比,“油酸钠+inhibitor”组肝细胞内脂滴缩小,脂质蓄积程度减弱,同时INSR表达显著增加(P<0.05),PI3K-AKT胰岛素信号通路表达恢复正常水平,这说明miR-27a-3p抑制剂可以抵抗油酸钠对肝细胞的损伤。(4)si RNA序列INSR-Bos-4156可以显著降低INSR蛋白表达(P<0.01),INSR敲低后导致PI3K-AKT胰岛素信号通路活性下降,引起肝细胞内糖原合成减少,脂解增多。结果表明,INSR是连接miR-27a-3p和下游PI3K-AKT胰岛素信号通路的重要中介。综上所述,本试验证实了奶牛发生脂肪肝时,肝内INSR表达下降并伴有PI3KAKT胰岛素信号受损;miR-27a-3p通过靶向INSR影响了PI3K-AKT胰岛素信号通路传导,进而调控糖脂代谢关键基因GSK-3β和HSL,参与奶牛肝细胞糖脂代谢过程。这表明,miR-27a-3p在未来可作为检测奶牛脂肪肝的潜在生物标志物和治疗位点,对诊断和治疗奶牛脂肪肝具有一定的应用价值。
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