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研究目的:构建人GRP78 miRNA表达载体,筛选出最佳干扰效果的干扰载体,转染EC109细胞,探讨其对EC109细胞增殖的影响。材料和方法:1、根据miRNA干扰原理,设计合成4对针对人GRP78的特异性miRNA干扰序列,连接到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR表达载体,分别命名为miR78-1、miR78-2、miR78-3、miR78-4,并通过测序鉴定。2、把测序正确的干扰质粒利用脂质体Lipofectamine 2000转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况以检测转染效率,通过杀稻瘟菌素筛选2周左右,得到稳定表达干扰质粒的细胞株,通过RT-PCR检测稳定筛选后HEK293细胞中GRP78 mRNA的表达水平。3、将最佳干扰效果的干扰质粒瞬时转染EC109细胞,通过RT-PCR检测转染24h后GRP78 mRNA的表达水平,利用CCK8检测转染干扰质粒0h、12h、24h、48h、72 h后EC109细胞的增殖情况。结果:1、DNA测序表明重组质粒中含有目的片段,且插入片段的碱基序列完整,没有碱基的突变以及丢失。2、建立了稳定表达干扰质粒的HEK293细胞株,稳定转染后HEK293细胞在荧光显微镜下观察均有绿色荧光蛋白表达。与阴性对照组、未转染组比较,在干扰组细胞中GRP78 mRNA的表达有不同程度的下降（P<0.05）,其中转染miR78-1组GRP78 mRNA的表达下降最明显（P<0.05）。3、miR78-1干扰质粒瞬时转染EC109细胞后,与未转染组、阴性对照组相比,细胞中GRP78 mRNA的表达下降（P<0.05）;CCK8检测结果表明转染miR78-1干扰质粒12, 24, 48, 72 h后,EC109细胞的增殖减慢（P<0.05）。结论:1、设计的4对干扰序列正确完整地克隆到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中,GRP78 miRNA表达载体构建成功。2、成功建立了GRP78基因“敲弱”的HEK293细胞模型,筛选出miR78-1为最佳干扰效果的干扰载体。3、miR78-1干扰质粒瞬时转染EC109细胞后,能抑制EC109细胞中GRP78 mRNA的表达,能抑制EC109细胞的生长。