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目的:探讨电针及针刺后血清外泌体（Acupuncture Exosome,Acu-exo）在脓毒症（Sepsis）中的抗炎作用及Acu-exo中起效的关键基因和网络机制。方法:研究内容一电针足三里穴防治脓毒症小鼠的效应平台研究24只雄性健康C57BL/6J小鼠随机分为Sepsis组（n=12）、Sepsis+EA组（n=12）,毫针针具规格为0.25×13s,刺入足三里穴约3-5mm,然后连接华佗牌电针仪,参数设置:连续波,频率10 Hz,强度为5,共刺激15min。电针结束后15min两组给予腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）（30mg/kg）制备脓毒症小鼠模型,观察记录小鼠24h内的生存时间及小鼠脓毒症评分（Murine sepsis score,MSS）。15只雄性健康C57BL/6J小鼠随机分为PBS组（n=5）、Sepsis组（n=5）和Sepsis+EA组（n=5）,电针结束后15min Sepsis组和Sepsis+EA组均给予腹腔注射LPS（24mg/kg）制备脓毒症小鼠模型,PBS组腹腔注射等量PBS溶液,采用ELISA法检测造模后2h三组血清炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平。研究内容二回输Acu-exo防治脓毒症小鼠的效应规律研究实验1正常小鼠Acu-exo制备的实验研究18只雄性健康C57BL/6J小鼠给予电针干预7天,1次/1天,第7天电针结束后用Exo Quick法提取Acu-exo,采用蛋白质印迹法（Western Blot,WB）、透射电镜法（Transmission electron microscope,TEM）和纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）对外泌体的标志物、形态及大小进行鉴定。实验2回输Acu-exo对脓毒症小鼠生存时间的影响24只雄性健康C57BL/6J小鼠分为Sepsis组（n=12）和Sepsis+Acu-exo组（n=12）。将实验1中制备的Acu-exo（0.4mg/m L,0.1m L/10g）进行腹腔注射,Sepsis组不给予回输。30min后两组给予腹腔注射LPS（30mg/kg）制备脓毒症小鼠模型,观察记录小鼠24h内的生存时间及MSS评分。实验3回输Acu-exo对脓毒症小鼠抗炎效应的观察15只雄性健康C57BL/6J小鼠随机分为PBS组（n=5）、Sepsis组（n=5）和Sepsis+Acu-exo组（n=5）,Sepsis组和Sepsis+Acu-exo组给予腹腔注射LPS（24mg/kg）制备脓毒症小鼠模型,Sepsis+Acu-exo组在造模前30min腹腔注射回输Acu-exo（0.4mg/m L,0.1m L/10g）,PBS组给予腹腔回输等量PBS溶液,采用ELISA法检测造模后2h三组血清炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平。实验4回输Acu-exo对脓毒症小鼠器官保护作用规律的观察15只雄性健康C57BL/6J小鼠随机分为PBS组（n=5）、Sepsis组（n=5）和Sepsis+Acu-exo组（n=5）,Sepsis组和Sepsis+Acu-exo组给予腹腔注射LPS（24mg/kg）制备脓毒症小鼠模型,Sepsis+Acu-exo组在造模前30min腹腔注射回输Acu-exo（0.4mg/m L,0.1m L/10g）,PBS组给予腹腔回输等量PBS溶液,采用HE染色观察回输Acu-exo对脓毒症小鼠2h和24h心、肺、肝、肾四个脏器损伤的影响。采用实时荧光定量法检测造模后24h肺组织中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平。研究内容三Acu-exo运载miRNA的高通量测序及防治脓毒症的网络机制初探实验1 Acu-exo运载miRNA的高通量测序及生物信息学分析30只健康雄性C57BL/6J小鼠分为NC组（n=15）、EA组（n=15）。NC组不给予任何干预,EA组电针7天,1次/1天,用Exo Quick法提取Acu-exo,采用高通量测序技术检测Acu-exo内miRNA的表达情况,并筛选出差异基因,预测差异靶基因后进行GO和KEGG富集分析。实验2 Acu-exo防治脓毒症重要靶点及作用机制的网络生物学分析将高通量测序预测得到的差异靶基因通过基因映射转换为人类基因,与Gene Cards数据库、Dis Ge NET数据库和OMIM数据库检索得到的人类脓毒症疾病靶点进行数据耦合,得到Acu-exo防治脓毒症的重要靶点。利用string数据库和cytoscape软件对关键靶点进行互作基因、信号通路和来源分析,探究Acu-exo在防治脓毒症中可能起效的生物学机制。结果:1.电针可以延长脓毒症小鼠的生存时间,降低MSS评分及抑制炎症因子的表达造模24h后,Sepsis组小鼠死亡12只,存活0只,存活率为0%,12只死亡小鼠的死亡时间分别是造模后10.29h、13.11h、16.04h、11.44h、12.53h、14.14h、14.31h、13.8h、14.45h、15h、15.14h、15.44h。Sepsis+EA组小鼠死亡只9,存活3只,存活率为25%,9只死亡小鼠死亡时间分别是造模后14.77h、23.30h、19.16h、19.49h、18.29h、15.20h、20.32h、15.30h、17.42h,表明电针可延长脓毒症小鼠的生存时间。腹腔注射LPS（30mg/kg）10小时后Sepsis组小鼠出现震颤、行动减少、迷失方向、毛发竖立、眼周白色分泌物及大便干结的表现,而Sepsis+EA组小鼠较Sepsis组有明显改善,MSS评分低于Sepsis组（P＜0.001）。与PBS组相比较,2h Sepsis组小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6水平明显升高（P＜0.01）,IL-1β有上升趋势。与Sepsis组相比较,2h Sepsis+EA组小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6明显降低（P＜0.05,P＜0.01）,IL-1β有下降趋势。2.回输Acu-exo可以延长脓毒症小鼠的生存时间,降低MSS评分及抑制炎症因子的表达BCA蛋白定量结果显示提取出的Acu-exo蛋白浓度为7.713087mg/m L。电泳显示蛋白CD63和CD9有条带,为阳性结果,表明外泌体提取较好。TEM观察发现提取出的血清外泌体均呈圆形、类圆形囊泡的形状,囊泡外周清晰可见膜性结构。NTA检测报告中MODE曲线线性流畅,提示所含杂质少,算数平均径为90.6nm,粒径峰值为89.6nm,与理论外泌体直径（20-200nm）相符。造模24h后,Sepsis组小鼠死亡12只,存活0只,存活率为0%,12只死亡小鼠的死亡时间分别是造模后10.29h、13.11h、16.04h、11.44h、12.53h、14.14h、14.31h、13.8h、14.45h、15h、15.14h、15.44h。Sepsis+Acu-exo组小鼠死亡11只,存活1只,存活率为8%,11只死亡小鼠死亡时间分别是造模后14.28h、15.48h、16.21h、17.01h、17.29h、18.32h、18.53h、19.32h、20.15h、20.54h、23.13h,表明回输电针7天正常小鼠血清外泌体可延长脓毒症小鼠的存活时间。腹腔注射LPS（30mg/kg）10小时后Sepsis组小鼠出现震颤、行动减少、迷失方向、毛发竖立、眼周白色分泌物及大便干结的表现,而Sepsis+Acu-exo组小鼠较Sepsis组有明显改善,MSS评分低于Sepsis组（P＜0.001）。与PBS组相比较,2h Sepsis组小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6水平明显升高（P＜0.01）,IL-1β有上升趋势。与Sepsis组相比较,2h Sepsis+Acu-exo组小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6明显降低（P＜0.01）,IL-1β有下降趋势。3.回输Acu-exo可以降低脓毒症小鼠肺脏的器官损伤程度及抑制炎症因子的表达HE染色结果发现心、肝、肾三个脏器2h和24h均未见明显变化。肺脏损伤最为明显,与PBS组相比,2h Sepsis组小鼠肺脏中肺泡壁略显增厚,肺泡细胞边界清晰,未见明显炎性细胞浸润,24h Sepsis组小鼠肺组织结构紊乱,肺泡壁明显增厚,并可见明显炎性细胞浸润;与Sepsis组相比,2h和24h Sepsis+Acu-exo组肺组织结构较为完整,小鼠肺脏中炎性细胞的浸润明显降低,仅有少量炎性细胞浸润,肺泡壁增厚明显减轻。PCR结果显示与PBS组相比较,24h Sepsis组小鼠肺组织炎症因子TNF-α和IL-1βm RNA表达倍数显著上升（P＜0.01,P＜0.001）,IL-6有上升趋势。与Sepsis组相比较,24h Sepsis+Acu-exo组小鼠肺组织中炎症因子TNF-α和IL-1βm RNA表达倍数显著降低（P＜0.05,P＜0.001）,IL-6有下降趋势。4.Acu-exo中相关miRNA在防治脓毒症中发挥重要作用高通量测序结果显示Acu-exo中有53个miRNA发生了显著变化,生物过程主要富集在调节细胞代谢、系统发育等,细胞组分主要富集在胶原三聚体复合物、细胞内等,分子功能主要富集在蛋白质结合、细胞外基质结构成分等方面,富集信号通路显示与炎症和免疫相关。网络生物学分析结果显示Acu-exo防治脓毒症的靶点来源于多器官、多系统,其互作基因和信号通路涉及炎症、免疫调节、代谢以及细胞的增殖和凋亡。结论:1.电针可延长脓毒症小鼠的生存时间及抑制炎症因子的表达,具有抗炎作用。2.回输Acu-exo具有针刺样作用,可延长脓毒症小鼠的生存时间,抑制炎症因子的表达及减轻肺组织的损伤程度。3.Acu-exo防治脓毒症的靶点来源于多器官、多系统,其运载的miRNA及靶基因在防治脓毒症中具有炎症、免疫和代谢等网络调节效应。