研究背景和目的:由乙肝病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染引起的乙型肝炎是严重的世界性公共卫生问题之一。目前全球范围内约有2.4亿慢性HBV感染者,每年有近70万人死于HBV感染相关的疾病。在抗乙肝病毒治疗中,I型干扰素是各肝病研究学会推荐的一线药物之一,但仍然存在着病毒耐药等亟待解决的问题,而其具体耐药机制尚不完全明确。1型干扰素作为固有免疫系统的重要成员,具有广谱抗病毒作用和重要的免疫调节功能,干扰素刺激基因是其发挥作用的最终效应分子。本团队前期研究表明,干扰素治疗前慢性乙肝患者肝组织内位于同一信号路上的两个干扰素刺激基因 ISG15(Interferon stimulated gene 15)和 USP18(Ubiquitin specific peptidase 18)的细胞表达特异性与疗效有关:治疗有效者中,ISG15/USP18主要在肝脏巨噬细胞(Kupffer细胞)中高表达,而治疗无效者中则主要在肝细胞中表达。在慢性丙肝患者中也有类似现象。动物实验显示,USP18敲除小鼠巨噬细胞主要为M2型,与野生型小鼠体内巨噬细胞主要为M1型截然不同。ISG15敲除小鼠巨噬细胞吞噬功能受到抑制,提示ISG15/USP18信号通路与巨噬细胞表型和功能密切相关。这些研究结果表明该信号通路在调节宿主固有免疫(影响干扰素抗病毒活性及巨噬细胞极化和功能)及肝炎病毒耐受干扰素导致持续感染中发挥着重要作用。本课题旨在从如下几个方面明确ISG15/USP18信号通路在乙肝病毒感染中的作用:1)ISG15/USP18信号通路对乙肝病毒复制的影响;2)ISG15/USP18对巨噬细胞极化和功能的影响;3))不同表型巨噬细胞(MI/M2)对肝细胞中干扰素信号通路的影响。为进一步阐明乙肝病毒慢性化过程及其耐受干扰素的机制寻找证据,并为筛选潜在的新型乙型肝炎治疗药物靶点提供理论支持。实验方法:1.通过转染高表达质粒,在能够产生感染性乙肝病毒颗粒的HepG2.2.15细胞中高表达ISG15、USP18或无酶活性的USP18-C64S,通过real-time PCR,western blot及ELISA等方法检测HBV复制情况;2.通过转染高表达质粒,在THP-1来源的M0巨噬细胞中高表达ISG15或USP18,然后诱导细胞极化。通过real-time PCR,流式细胞术,乳胶微粒吞噬实验,中性红摄取实验等,检测ISG15/USP18对巨噬细胞标志物(细胞因子、酶及表面分子等)表达、活性氧化物产生、吞噬功能以及胞饮功能的影响。3.(1)将从USP18基因敲除小鼠及野生型小鼠分离到的腹腔渗出巨噬细胞(M1型和M2型)分别与野生型小鼠的原代肝细胞通过transwell系统进行共培养,在共培养后不同的时间点收集培养基上清,ELISA检测上清液中代表性M1/M2型细胞因子的表达情况。同时使用干扰素刺激肝细胞,real-time PCR检测肝细胞中干扰素刺激基因的表达情况,评价肝细胞对干扰素刺激的反应(敏感性)。(2)使用氯膦酸二钠脂质体特异性地清除野生型小鼠体内的巨噬细胞(M1型),然后通过尾静脉注射的方式用从USP18基因敲除小鼠分离到的腹腔渗出巨噬细胞(M2型)对其进行外源性巨噬细胞置换。通过LPS制造炎性微环境激活置换的巨噬细胞,然后经由腹腔注射干扰素,评价小鼠肝组织对干扰素刺激的反应:ELISA检测小鼠血清中代表性M1/M2型细胞因子的表达;real-time PCR检测肝细胞中干扰素刺激基因的表达;HE染色及血清酶学检测评价小鼠肝脏炎症水平。结果:1.高表达ISG15或USP18以剂量依赖的方式促进HepG2.2.15细胞培养基中HBVDNA的表达,但对细胞内总HBVDNA、cccDNA、pgRNA、HBcAg及培养基中的HBeAg和HBsAg没有明显影响。siRNA抑制ISGylation所必需的E1激活酶UBE1L的表达之后,ISGylation水平明显下降,ISG15对HBV的这种促进作用也随着消失;而与野生型USP18相比,无酶活性的USP18C64S对HBV有着类似的作用。高表达ISG15或USP18能够促进部分干扰素刺激基因的表达,但是对内源性Ⅰ型干扰素的表达没有明显影响。2.在PMA诱导分化的MO THP-1巨噬细胞中高表达ISG15或USP18都能够促进M1型巨噬细胞标志物的表达、抑制M2型标志物的表达,降低巨噬细胞对中性红溶液的摄取、降低ROS的表达,并抑制巨噬细胞对荧光标记乳胶微粒的吞噬。3.(1)USP18基因敲除小鼠腹腔渗出巨噬细胞主要表达M2型细胞因子(GM-CSF以及IL-10),而野生型小鼠腹腔渗出巨噬细胞主要表达M1型细胞因子(TNF-α及IL-12)。I型干扰素刺激后,与USP18基因敲除小鼠腹巨噬细胞共培养的肝细胞中干扰素刺激基因Mx1、ISG15及USP18表达明显高于对照组。(2)与对照组相比,进行了 USP18基因敲除小鼠巨噬细胞置换的野生型小鼠血清中M2型细胞因子表达水平更高;在Ⅰ型干扰素刺激下,实验组小鼠肝组织中干扰素刺激基因Mx1、ISG15及USP18表达明显更高;HE染色显示,LPS处理并不导致严重炎症反应,但血清酶学显示,LPS处理会对肝脏功能造成一定损伤,而巨噬细胞置换能够逆转LPS引起的小鼠ALT和AST的升高。结论:1.ISG15/USP18的高表达对HepG2.2.15细胞中HBV的产生有促进作用,这种作用与ISGylation有关,而不依赖于USP18的酶活性及内源性干扰素信号通路。2.高表达ISG15或USP18能够促进PMA诱导分化的MO THP-1巨噬细胞向M1型极化,抑制巨噬细胞吞噬、胞饮及ROS产生等功能。3.M2型巨噬细胞很可能通过释放细胞因子、调节炎症微环境的方式提高肝细胞对Ⅰ型干扰素的敏感性。综上所述,ISG15/USP18信号通路至少可能通过两种不同的机制造成HBV耐受干扰素,并有利于HBV持续感染:1)ISG15/USP18在肝细胞中高表达时,以不依赖于内源性干扰素信号通路的方式促进肝细胞中HBV的产生(释放);2)ISG15/USP18在巨噬细胞中相对低表达时,巨噬细胞主要为M2样表型,以分泌细胞因子调节肝细胞周围微环境的方式,造成在干扰素治疗前便出现Ⅰ型干扰素信号通路的过度激活,导致对干扰素治疗的耐受;反之,ISG15/USP18在巨噬细胞中相对高表达时,巨噬细胞主要为M1样表型,不会造成I型干扰素信号通路的过度激活,表现为对干扰素治疗敏感。