论文部分内容阅读
白细胞介素2受体αlpha链(IL-2Rα)作为白细胞介素2(IL-2)的特异性受体链,是T细胞活化的特异性表面标志,在IL-2发挥生物学功能的过程中具有重要的作用;白细胞介素18(IL-18)是一种具有广阔应用前景的新型免疫佐剂和免疫治疗剂,同时亦可促进免疫调节因子γ-干扰素(IFN-γ)和IL-2的表达,增强对机体的保护。参考鸡白细胞介素2受体αlpha链(ChIL-2Rα)和鸭白细胞介素2受体αlpha链(DuIL-2Rα)cDNA序列设计引物,分别利用3′RACE和5′RACE技术在国内外首次克隆了鹅白细胞介素2受体αlpha链的cDNA(GoIL-2Rα)。克隆的cDNA序列长1027bp,其cDNA编码一条由240个氨基酸组成的前体蛋白,该前体蛋白含有20aa残基构成的信号肽序列。预测的GoIL-2Rα蛋白与DuIL-2Rα同源性87.08%,与ChIL-2Rα同源性53.94%。GoIL-2Rα的10个半胱氨酸残基中,有8个对应位点在禽类同系物中完全保守。进化分析表明鹅和鸭的亲缘关系最近,和哺乳动物的亲缘关系比较远,显示出明显的种属差异。二级结构分析表明,GoIL-2Rα蛋白羧基末端含有24个氨基酸残基(217-240)构成的跨膜区。采用相同的方法克隆获得了鹅白细胞介素18的cDNA(GoIL-18)。克隆的cDNA序列长863bp,其cDNA编码一条由200个氨基酸组成的前体蛋白。经预测该前体蛋白无明显的疏水信号肽序列,也缺乏传统的N-糖基化位点,这点与哺乳动物类似。在哺乳动物中,有一个前导序列,通过IL-1β转换酶(ICE或者Caspase-1)在特定位点的切割使之称为有活性的成熟蛋白。将预测的GoIL-18前体蛋白序列与禽类及哺乳动物的序列进行比较分析,可知GoIL-18前体蛋白中含有30aa残基构成的前导序列。将GoIL-2Rα成熟蛋白胞外区的PCR产物亚克隆至原核表达载体pET-30a,构建重组表达载体pET-30a-mIL-2RαQ,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导实现了GoIL-2Rα蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达蛋白的分子量约为34kDa,表达量约为19.4%,可被anti-His单克隆抗体识别。可溶性分析表明,经pET-30a系统表达的GoIL-2Rα以包涵体的形式存在,表达的重组蛋白可经Ni2+柱进行纯化。以GoIL-18的cDNA为模板,PCR扩增GoIL-18成熟蛋白的编码区,并将此序列连入载体pET-30a中,构建pET-30a-mIL-18重组表达载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,在大肠杆菌中获得了表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达蛋白的分子量约为28kDa,表达量随着诱导时间的延长而增加,约为23.3%-33.3%,可被anti-His单克隆抗体识别。可溶性分析表明,该蛋白以包涵体形式存在。为了便于检测GoIL-18蛋白的活性,对其在大肠杆菌中的表达条件进行优化,主要是改变诱导温度、降低IPTG的量及改变培养基成份,结果表明在诱导温度为25℃,培养基中添加1%甘氨酸,1%TritonX-100时,上清中有很少量的rGoIL-18蛋白。将GoIL-18成熟蛋白的编码区插入转移载体pFastBacHTB的多克隆位点,构建重组转移载体pFastBacHTB-mIL-18,转化DH10BacTM感受态进行体外重组,将鉴定正确的重组杆粒转染昆虫细胞(Sf9),转染后Sf9细胞的形态观察和重组病毒DNA的提取鉴定表明,重组杆粒已转入Sf9细胞中,并且在细胞中获得了扩增。以纯化后的rGoIL-18原核表达产物为抗原制备阳性血清,对rGoIL-18在Sf9细胞中的表达进行鉴定。间接免疫荧光和Western blot鉴定结果表明rGoIL-18在Sf9细胞中获得表达。利用体外微量细胞病变抑制法定性检测刺激后淋巴细胞培养上清中IFN-γ的抗病毒活性,间接对两个系统表达的rGoIL-18的活性进行检测;利用MTS试剂盒检测两个系统表达的rGoIL-18对鹅脾淋巴细胞增殖的作用,结果显示: 1)诱导24h后所收集的细胞培养上清中检测不到IFN-γ的活性,48h和72h收集的培养上清中可检测到IFN-γ活性,没有检测到rGoIL-18蛋白对新城疫病毒的抑制活性; 2)利用两个系统表达的rGoIL-18均可促进淋巴细胞的增殖(P<0.01),rGoIL-18作用48h时刺激指数最高,与其他时间相比,差异显著。将GoIL-2和GoIL-2Rα分别连入载体pCMV-Myc、pCMV-HA中,构建重组真核表达载体pCMV-Myc-IL-2、pCMV-HA-IL-2Rα,将两者共转染CHO细胞,通过提取细胞RNA进行RT-PCR鉴定及间接免疫荧光鉴定,两者在CHO细胞中获得了表达。利用免疫共沉淀研究GoIL-2与受体α在体外的相互作用,结果未出现预期的目的条带,表明GoIL-2与受体α的亲和力很低,利用免疫共沉淀实验无法研究两者间的相互作用。制备GoIL-2单克隆抗体,利用昆虫细胞表达的rGoIL-2蛋白鉴定出具较高活性的单克隆抗体,用分泌该单克隆抗体的细胞株制备腹水并进行纯化,同时纯化实验室保存的兔抗GoIL-2阳性血清,以纯化后的腹水为捕获抗体,阳性血清为检测抗体初步建立检测GoIL-2的抗原捕获ELISA方法,对rGoIL-18刺激后的淋巴细胞培养上清中的GoIL-2含量进行检测,两个系统表达的rGoIL-18蛋白刺激淋巴细胞48h收集的细胞培养上清中均可检测出IL-2,与对照组相比差异极显著(P<0.01),昆虫细胞表达的rGoIL-18蛋白刺激细胞72h收集的上清液中也可检测出IL-2,与48h相比差异显著。这说明rGoIL-18蛋白可促使淋巴细胞分泌IL-2。