背景:MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性、功能性、长度在19-23nt的非编码单链小RNA,并在哺乳动物发育过程中起基因调控作用。成熟的miRNA与靶基因mRNAs的3’非翻译区(3’UTR)结合,抑制靶基因蛋白的翻译,或通过诱导mRNA降解,来调控基因的表达。mi RNA参与细胞增殖与凋亡、胰岛素分泌以及个体发育等过程。在哺乳动物体内,性发育启动受到下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)的调控,其所分泌的各种激素水平可以直接调控性发育启动并维持机体的生殖功能。下丘脑GnRH神经元脉冲式分泌GnRH,是性发育启动的关键性事件。当性发育启动时,GnRH神经元分泌GnRH的频率和脉冲幅度都显著提高。越来越多的证据证明,在性发育启动中起到至关重要作用的是基因的时空表达。而微小RNA(microRNAs/mi RNAs)可以在多个层面调节基因的表达,因此可以调控性发育的不同通路。本实验室一直致力于研究小鼠性发育调控的遗传和分子机制,发现有许多micro RNA参与了这一重要的生命过程的调控。目的:在来源于下丘脑GnRH神经元的GT1-7细胞中,构建一种高度灵敏的GnRH表达调控报告系统,通过检测调控因子处理之后的荧光强度的变化来衡量其对Gn RH的调控能力。通过双荧光素酶的报告系统筛选靶向GnRH的miRNA,检测miRNA在不同组合模式下,对GT1-7细胞中的GnRH表达量影响。这种不同的组合作用可以模拟生物的基本生理状态,探究miRNA对GnRH的调控作用,深入解析其调控途径,从而完善性发育基因调控网络。方法:通过CRISPR/Cas9系统可将GnRH上下游同源臂和绿色荧光蛋白(EGFP)基因通过同源重组的方式插入PUC19载体上,构建成GnRH打靶载体。根据GnRH基因位置,通过CRISPR/Cas9系统设计最符合条件的sgRNA,构建成sgRNA载体。在GT1-7细胞中,共转染两种载体,通过流式细胞仪分选阳性单克隆细胞,扩大培养成含绿色荧光的报告系统。通过Targetscan、mirDB、microRNA target prediction、mirwalk、PicTar、mirnada等数据库预测出靶向GnRH的7种miRNA,其中包括mmu-miR203-3p、mmu-miR574-3p、mmu-miR100-3p、mmu-miR370-5p mmu-miR148a-3p、mmu-miR148b-3p、mmu-miR152-3p。将GnRH全部的3’非翻译区(3’UTR)构建在psi-check2载体上,构建成GnRH表达载体,与miRNA mimics一起瞬时转染293细胞,通过双荧光素酶的报告系统筛选了靶向GnRH的4种mi RNA,并将筛选出的4种mi RNA mimics转染GT1-7细胞,通过GnRH表达量检测进一步筛选,获得靶向GnRH的3种miRNA。为模拟生物体的生理状态,将三种浓度相同的miRNA mimics按不同的组合模式转染GT1-7细胞,检测其对Gn RH及其它性发育相关基因表达量的影响。结果:已成功构建一种高度灵敏的GnRH表达调控报告系统,在转染GT1-7细胞后,经过流式细胞仪检测到荧光值的变化,但经过流式细胞分选时,未能分选出荧光细胞。在293细胞中,通过双荧光素酶的报告系统筛选出靶向GnRH基因的4种miRNA,其中包括mmu-miR203-3p、mmu-miR574-3p、mmu-miR100-3p、mmu-miR370-5p将4种miRNA在GT1-7细胞中进一步实验,筛选出除mmu-miR203-3p以外的三种mi RNA。为了模拟生物的基本生理状态,检测在不同组合模式下mi RNA对Gn RH及性发育相关基因的检测,结果显示,单个miRNA转染,两两联合转染和三个联合转染对GnRH的表达有不同程度的影响,且联合转染比单个转染对GnRH的影响更有效,对其他性发育相关基因的表达也有影响,但影响都小于GnRH的变化。结论:在不同浓度时,靶向Gn RH基因的miRNA对GnRH的表达有不同影响,在相同的浓度下,mi RNA的联合转染比单个转染对GnRH的作用更为显著。在检测性发育相关基因时,各基因的表达量会有不同程度的变化,但变化都不如Gn RH显著,可能是因为Gn RH的间接调控作用的影响,需要进一步深入研究。综上,GnRH基因受到不同miRNA的调控,并且miRNA之间可以通过联合作用在多个层面调节GnRH的表达,更加完善性发育基因调控网络。