目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率居女性恶性肿瘤首位。研究显示乳腺癌新发病例占女性所有癌症新发病例的15%[1]。近年来,尽管诊断和治疗技术不断提高,但其死亡率并没有明显下降。炎症小体是细胞内的一种多蛋白复合体,它通过识别病原体和各种危险信号,诱导炎症反应,从而在固有免疫中发挥重要作用[2]。NLRP3 炎症小体(NOD-like receptor family,pyrin domain containing protein 3,NLRP3)是目前功能研究的最明确的一个炎症小体。NLRP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein,ASC)和半胱天冬酶1(caspase-1)前体组装后,进一步募集caspase-1前体,促使caspase-1前体自我激活,后者切割白细胞介素1β(interleukin 1 beta,IL-1β)前体和白细胞介素18(interleukin 18,IL-18)前体,成为具有活性的IL-1β和IL-18,这些产物能激活下游的信号通路,促进炎性因子的释放,增强炎症反应[3]。在过去的十几年里,关于NLRP3炎症小体的研究多集中在固有免疫领域,而对于它在癌症发生发展过程中的作用机制与临床意义研究较少,而且研究的结论尚不统一[4]。研究显示,NLRP3除了表达在固有免疫细胞以外,也能够表达在上皮细胞[5],并参与部分上皮来源的肿瘤的进展[6]。乳腺癌是典型的上皮起源的恶性肿瘤,关于NLRP3炎症小体在乳腺癌中的表达与作用,目前尚未见到文献报道。为了研究NLRP3炎症小体是否参与了乳腺癌的发生与进展过程,我们收集了171例乳腺癌患者的手术切除的乳腺癌组织标本,制作了组织切片并进行免疫组织化学染色,对NLRP3炎症小体在乳腺癌组织中的表达水平及其与临床病理参数之间的相关关系进行了研究。本研究旨在探讨NLRP3炎症小体的表达水平与乳腺癌进展的关系,为阐明乳腺癌发生与进展的机制和对其进行分子靶向治疗提供新的思路。方法1.研究对象收集乳腺导管癌患者病例171例,采用国际抗癌组织的癌症TNM分类系统确定病人的肿瘤分级。对于已发生淋巴结转移的乳腺癌患者,同时留取患者的乳腺癌原发病灶和转移病灶的组织标本。2.研究方法2.1制备石蜡切片:留取乳腺癌患者治疗性切除的组织标本,经脱水、透明、浸蜡、包埋后切成5 μm厚的石蜡切片。对于有淋巴结转移的病人,原发病灶和转移病变部位分别进行取材并制备石蜡切片。2.2免疫组织化学染色:分别用NLRP3炎症小体组分的抗体对石蜡切片进行免疫组织化学染色,包括抗NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的抗体。同时对于临床上常用于评价乳腺癌疾病状况的一些分子进行检测。检测的分子包括孕激素受体(progesterone receptor,PR)、雌激素受体(estrogen receptor,ER)和人表皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor-2,Her-2)。2.3免疫组织化学染色的结果判读:在高倍显微镜下观察染色结果,按每个视野中阳性细胞的染色强度分为四个级别,分别记为0、1、2、3分。根据分值再进一步分为低表达和高表达两个级别,其中染色强度为0分和1分的归为低表达组,染色强度为2分和3分的归为高表达组。每个蜡块选一张切片,每张切片至少随机观察6个视野,每张切片评估两次,分别计分取均值。每张切片由两名病理医师在双盲情况下判定染色结果。2.4统计学处理:应用SPSS16.0统计软件进行数据分析,采用Fisher’s精确卡方检验进行分类变量资料的比较。变量之间的相关性采用Spearman等级相关系数进行分析。所有分析都采用双尾P值,P<0.05被认为有统计学意义。结果1.NLRP3炎症小体组分在乳腺癌组织中呈阳性表达且各组分表达水平呈显著正相关。NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β在乳腺癌组织中呈现阳性染色,并且均为胞浆染色。在乳腺癌原发病灶组织中,NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1 β的阳性表达率分别为51.6%、68.2%、73.0%和53.5%。我们对NLRP3炎症小体组分的表达水平进行了深入分析,结果显示,NLRP3与Caspase-1的表达水平呈显著性正相关关系,P=0.001;NLRP3与IL-1β的表达水平呈显著性正相关关系,P<0.001;Caspase-1与IL-1 β的表达水平呈显著性正相关关系,P=0.037。2.在乳腺癌原发病灶组织中,NLRP3炎症小体组分低表达的患者组有更高的腋窝淋巴结转移率。我们对乳腺癌原发病灶组织中NLRP3炎症小体的组分的表达情况与病人的转移状况进行了进一步的关联分析,结果显示,NLRP3低水平表达组患者的淋巴结转移率显著高于高水平表达组,P=0.038;IL-1β低表达组患者的淋巴结转移率显著高于高表达组,P=0.001。3.乳腺癌淋巴结转移灶中NLRP3炎症小体组分的表达水平显著低于在原发灶中的表达水平。我们对NLRP3炎症小体在乳腺癌原发灶与转移灶中的表达水平进行了进一步的比较分析,结果显示,NLRP3在乳腺癌的腋窝淋巴结转移灶中的表达水平显著低于其在乳腺癌原发灶中的表达水平,P=0.012。ASC在乳腺癌腋窝淋巴结转移肿瘤组织中表达水平显著低于其在乳腺癌原发灶组织中的表达水平,P=0.003。IL-1 β在乳腺腋窝淋巴结转移灶中的表达水平与其在乳腺癌原发灶组织中的表达水平相比,显著下降,P=0.001。4.与原位癌相比,NLRP3炎症小体组分在浸润癌组织中的表达水平显著下调。我们进一步对浸润癌患者的原位癌和浸润癌组织中NLRP3炎症小体组分的表达水平进行了分析和比较,结果显示,NLRP3炎症小体组分在浸润癌组织中的表达水平显著低于在原位癌组织中的表达水平。同一病人的浸润癌组织切片上NLRP3炎症小体组分NLRP3、ASC、Caspase1和IL-1 β的表达水平与其在原位癌组织中的表达水平相比,显著性下调。5.在腋窝淋巴结转移癌组织中,NLRP3炎症小体组分的表达水平与PR的表达水平正相关。我们对NLRP3炎症小体组分的表达水平与临床常用的用于乳腺癌疾病状态评价的指标PR的表达水平进行了相关性分析,结果显示,在乳腺癌患者的腋窝淋巴结转移组织中,NLRP3的表达水平与PR的表达水平呈显著性正相关,R=0.487,P=0.002;ASC的表达水平与PR的表达水平显著正相关,R=0.37,P=0.022;IL-1β的表达水平与PR的表达水平显著正相关,R=0.318,P=0.048。6.在乳腺癌组织中PR的表达水平与乳腺癌临床病理参数的关系。在乳腺癌组织中,PR的表达水平与ER的表达水平显著正相关,P<0.001。PR的表达水平与病理分级呈显著性负相关关系,P=0.026。PR的表达水平与Her-2的表达水平呈显著性负相关关系,P<0.001。这些结果显示,该研究收集的病例符合乳腺癌的一般临床特征。结论1.在乳腺癌组织中,NLRP3炎症小体在乳腺癌细胞浆中呈阳性表达,其中NLRP3、Caspase-1和IL-1 β的表达水平之间呈显著性正相关关系,提示NLRP3炎症小体组分以一个复合物的形式在乳腺癌组织中作为一个整体共同发挥效应。2.乳腺癌原发病灶中NLRP3炎症小体组分的表达水平与乳腺癌的腋窝淋巴结转移率呈显著性负相关关系,并且,NLRP3炎症小体组分NLRP3、ASC和IL-1β在乳腺癌转移组织中的表达水平显著低于原发灶的表达水平,在浸润癌组织中的表达水平显著低于在原位癌组织中的表达水平。这些结果提示,NLRP3炎症小体的表达下调可能参与了乳腺癌的进展和转移。3.乳腺癌组织中NLRP3炎症小体的表达水平与孕激素受体PR的表达水平呈显著性正相关关系,提示NLRP3炎症小体的表达可能受到PR的调控,在乳腺癌中发挥抑制肿瘤进展的效应。创新点及意义1.本课题首次研究了 NLRP3炎症小体在乳腺癌组织中的表达水平,结果显示在乳腺癌组织中,NLRP3炎症小体组分的表达水平之间呈显著性正相关,提示NLRP3以一个炎症分子平台的形式共同在乳腺癌组织中发挥效应。2.本课题首次发现,乳腺癌原发病灶中NLRP3炎症小体组分的表达水平与乳腺癌的腋窝淋巴结转移率呈显著性负相关关系,提示NLRP3表达缺失的患者更易于发生转移。NLRP3炎症小体组分在腋窝淋巴结转移灶中的表达水平显著低于原发灶。NLRP3炎症小体组分在浸润癌组织中的表达水平显著低于在原位癌组织中表达水平。以上结果均提示,NLRP3炎症小体的表达下调和缺失,可能参与了乳腺癌的进展。3.本课题首次研究了临床乳腺癌组织中NLRP3炎症小体的表达水平与PR的表达水平之间的相关性,结果显示二者的表达水平呈显著性正相关,提示NLRP3炎症小体在乳腺癌中的表达可能受到PR的调控。4.本研究首次采用人乳腺癌临床组织标本作为研究对象,研究NLRP3炎症小体与乳腺癌进展的关系,与实验动物模型中的研究相比,更能真实地反映病人体内病理状态,所得到的结论更具有说服力。综上所述,本课题首次采用人乳腺癌的临床组织标本中对NLRP3炎症小体组分的表达水平进行了检测,并对其与临床指标的相关性进行了深入分析,研究结果提示,NLRP3炎症小体在乳腺癌组织中的表达下调和缺失可能参与了乳腺癌的进展和转移。该研究结果进一步提示,NLRP3炎症小体有可能成为预测乳腺癌进展和预后的新型生物标记,为乳腺癌的免疫调节治疗和乳腺癌疫苗的研制提供了新的思路。核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族3(nod-like receptor family,pyrin domain containing 3,NLRP3)是 NOD 样受体(nod-like receptor,NLRs)家族的一员,并且是目前研究得最为清楚的一员。它招募凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein,ASC)、半胱天冬酶 1(caspase-1)共同构建NLRP3炎症小体,剪切白细胞介素1 β(interleukin 1 beta,IL-1β)前体和白细胞介素18(interleukin 18,IL-18)前体,促进他们的成熟和释放[1]。caspase-1与IL-1 β是炎症过程中的两个关键介质。NLRP3蛋白由NLRP3基因编码生成,主要表达在巨噬细胞、上皮细胞和树突细胞等[2]。目前已经发现NLRP3基因大约有60种单核苷酸多态性[3]。这些基因位点的多态性改变与炎症小体的激活密切相关,从而影响IL-1β和IL-18等炎症因子的生成和释放,导致体机出现异常的炎症状态。癌症是世界范围内的公共健康问题,在美国是位居第二位的导致患者的死亡原因[4]。在中国,癌症的发病率和死亡率一直在持续增长,自2010年起成为中国疾病主要的死亡原因之一[5]。癌症的发生可能与遗传因素、环境因素、自身因素等多种原因有关,其中遗传因素约占60%[6]。很多癌症已经被证实与持续感染和炎症有关,如幽门螺杆菌感染患者的胃癌发病率明显增高,宫颈癌患者大多都是高危人乳头瘤病毒感染患者等。有研究显示,炎症小体在癌症的发病过程中发挥重要作用[7]。目前国内外已经有一些关于NLRP3基因单核苷酸多态性与癌症发病风险关联的研究,但是研究结论尚不统一。在本研究中,我们对NLRP3单核苷酸多态性与癌症的易感性之间进行Meta关联分析,综合评估NLRP3基因单核苷酸多态性与癌症易感性的关系。目的1.研究NLRP3基因rs35829419位点单核苷酸多态性与癌症易感性之间是否存在关联。2.研究NLRP3基因rs10754558位点单核苷酸多态性与癌症易感性之间是否存在关联。3.研究NLRP3基因rs10733113位点单核苷酸多态性与癌症易感性之间是否存在关联。方法1.文献检索检索以下网络检索资源和数据库:Elsevier science direct、Web of science、PubMed、EMBase、weley library。2.文献筛选和质量评价收集有关 NLRP3 基因 rs35829419、rs10754558 和 rs10733113 位点单核苷酸多态性与发病风险的文献,把不符合要求的文献剔除。用Thakkinstian等[8]在研究中报道的文献质量评价量表来评价纳入研究的质量。3.数据及相关信息的提取提取文献的第一作者、发表时间、国家、种族、期刊、疾病及诊断标准、对照来源、基因型分布、哈迪-温伯格平衡检验(Hardy-Weinberg equilibrium test,HWE)、基因检测方法等信息。4.统计分析使用统计软件Review Manager5.0进行统计分析。采用目的基因单核苷酸多态性在病例组和对照组发生的比值比(odds ratio,OR)来分析效应量。采用Z检验来评估总体效应。分别以等位基因模型(X ks Y)、共显性基因模型(XX ks YY、XX vs XY、XY ks YY)、显性基因模型(XX + XY vs YY)、隐形基因模型(XX VsXY + YY)等来合并统计OR值、95%置信区间(confidence interval,CI)并计算总效应值Z和P值。采用Review Manager5.0进行异质性检验。当P<0.1或者I2≥50%时,表示各研究的异质性较大,需要分析产生异质性的原因,如果不能去除该项研究,就采用随机效应模型进行统计分析;如果P≥0.1或者I2<50%时,则采用固定效应模型。应用敏感性分析判断去除某一项研究是否会影响总体效应。采用Review Manager5.0制作漏斗图来检验纳入的文献是否存在发表偏倚。结果1.文献检索结果:本研究共纳入7篇文献。其中关于NLRP3基因rs35829419位点的有6篇文献,共7个研究;关于NLRP3基因rs10754558位点的有3篇文献,共4个研究;关于NLRP3基因rs10733113位点的有2篇文献,共2个研究;2.被纳入的研究情况:13个病例对照研究发表于2012年至2017年,共纳入癌症患者2245例,正常对照4672例。3.NLRP3基因rs35829419位点单核苷酸多态性的Meta分析结果:NLRP3基因rs35829419位点单核苷酸多态性与癌症易感性无显著性相关,P>0.05。剔除一例不符合哈迪-温伯格平衡定律的研究后,rs35829419单核苷酸多态性与癌症易感性之间仍无显著性相关,P>0.05。剔除对研究的异质性影响较大的数据后,rs35829419单核苷酸多态性与癌症易感性仍无显著性相关,P>0.05。4.NLRP3基因rs10754558位点单核苷酸多态性的Meta分析结果:对纳入的研究进行异质性检验,结果显示各研究间无明显异质性。采用固定效应模型进行Meta分析,结果显示NLRP3基因rs10754558位点单核苷酸多态性与癌症易感性之间无显著性相关(P>0.05)。5.NLRP3基因rs10733113位点单核苷酸多态性的Meta分析结果:rs10733113单核苷酸多态性共显性基因模型(GA vs AA)与癌症易感性之间有显著性相关关系(0R=0.51,95%CI=0.27-0.97,P=0.04)。携带 rs10733113 位点AA基因型的个体相对于GA基因型个体存在更高的癌症发病风险。其余基因模型与癌症的易感性之间无显著性相关关系(P>0.05)。结论1.NLRP3基因rs35829419位点单核苷酸多态性等位基因模型(AvsC)、共显性基因模型(AA CC)和(AA vs AC)及(AC vs CC)、显性基因模型(AA+AC vs CC)、隐性基因模型(AA vs AC+CC)都与癌症的发病风险无显著性相关关系。2.NLRP3基因rs10754558位点单核苷酸多态性等位基因模型(C vs G)、共显性基因模型(CC vs GG)和(CC vsCG)及(CG vs GG)、显性基因模型(CC+CG vs GG)、隐性基因模型(CC vs CG+GG)都与癌症的发病风险无显著性相关关系。3.NLRP3基因rs10733113位点单核苷酸多态性等位基因模型(G vsA)、共显.性基因模型(GG vs AA)和(GGvs GA)、显性基因模型(GG+GA AA)、隐性基因模型(GG vs GA+AA)都与癌症的发病风险无显著性相关,差异无统计学意义。共显性基因模型(GA vs AA)与癌症的发病风险之间呈显著性相关关系,AA基因型个体的癌症易感性显著高于GA基因型个体。4.上述研究结果需要更多的大样本资料和高质量的系统研究来进一步证实。