FADD在乳腺癌细胞中调控Rheb表达参与细胞自噬的机制研究

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Fas-associated protein with death domain(FADD)是经典的凋亡配体蛋白,由N端的死亡效应结构域(death effector domain,DED)和C端的死亡结构域(DeathDomain,DD)构成。当凋亡信号激活死亡受体形成三聚体时,FADD通过自身DD结构域与死亡受体DD相互作用被招募到细胞膜下方,然后通过其DED结构域的同源相互作用,招募caspase-8前体结合而形成死亡诱导复合物(DISC),激活Caspase-8,最终导致细胞凋亡。除了经典的凋亡功能外,FADD还参与细胞增殖、胚胎发育、自噬和肿瘤发生等多种非凋亡过程。近期研究表明FADD在肝癌、肺癌、黑色素瘤等多种肿瘤中异常表达,并且可能作为头颈鳞状细胞癌的肿瘤标志物,提示了FADD在肿瘤发生发展中的重要角色。因此,阐明FADD在肿瘤发生过程中的机制,可能为肿瘤治疗开辟新的思路或提供新的靶点,研究具有较好的创新性及理论指导意义。  首先,利用在线数据库Oncomine平台,我们对FADD在肿瘤中的表达进行了系统分析。结果表明,在人乳腺癌中FADD表达异常升高,并且通过KaplanMeier plotter在线工具分析获得FADD表达水平与预后不良密切相关。为了确认这一发现,我们获取了乳腺癌组织进行免疫组化验证,通过30例乳腺癌病人样本的组织芯片染色结果显示,与癌旁组织相比,FADD表达水平在肿瘤组织中明显升高。  接着,我们采用液质联用分析和生物信息学手段来寻找FADD可能参与的信号途径。在乳腺癌MCF-7细胞中敲减FADD,然后进行全蛋白组分析,找出与FADD表达水平相关的蛋白分子,通过GeneGO/MetaCore软件分析发现Rheb-mTORC1通路发生紊乱。  mTOR是一种重要的Ser/Thr激酶,能够应对多种刺激(包括营养,能量,压力),通过磷酸化核糖体蛋白激酶p70s6k和翻译起始因子4E-BP1,促进相关蛋白的合成,从而调节细胞生长、增殖、衰老和自噬等过程。mTOR关键的上游激活因子是Rheb(Ras homolog enriched in brain)。Rheb属于Ras蛋白超家族,是一种小GTPase酶蛋白,由184个氨基酸组成,对mTORC的激活依赖雷帕霉素作用。Rheb-mTORC1通路受上游PI3K/Akt和TSC1/2信号途径的调控,在多种肿瘤类型中过度激活。与肿瘤发生密切相关的如细胞增殖、周期调控、细胞迁移等过程都受到mTOR的调控。  FADD对Rheb-mTORC1通路的影响是本研究的重点。在乳腺癌细胞株MCF-7和MDA231中,通过QPCR检测和启动子报告基因分析,我们发现FADD能够在转录水平调控Rheb的表达,不影响Rheb mRNA稳定性。磷酸化的p70s6k表示mTOR的激活程度,通过干扰FADD表达,我们检测发现p70s6k的磷酸化水平降低,说明FADD表达水平降低能够减弱mTOR通路的激活。此时,转染Rheb表达质粒进行Rheb表达恢复时,p70s6k的磷酸化水平呈现相应地提高,说明FADD调控Rheb的表达能够影响mTORC1活性。  mTORC1是细胞感受各种营养物质水平并控制生物合成和细胞分裂的关键分子,在营养充足时启动生物合成并抑制自噬;在营养匮乏时活性关闭,自噬得以激活。mTORC1和自噬在细胞代谢调控中都发挥重要作用,一直以来在衰老、肿瘤以及糖尿病等众多疾病领域备受关注。有研究报道FADD敲除能够诱导自噬,那么FADD是否通过影响Rheb-mTORC1参与自噬调节呢?在乳腺癌细胞株中,采用无血清诱导自噬产生,FADD敲减引起的自噬增加,当提高Rheb表达后细胞自噬得到缓解。此外,FADD敲除对细胞增殖的抑制也可以通过恢复Rheb表达而改善。FADD干扰能够降低Rheb表达,而FADD干扰所产生的自噬和生长抑制都能够通过补充Rheb而抵消,这些现象都表明FADD在自噬和增殖中的调控作用可能通过改变Rheb-mTORC1的活性来实现。
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