背景与目的:血管炎是紫癜性肾炎(HSPN)的主要病理特征,肾小球血管病变对HSPN的发病机制和疾病进展至关重要,因此对HSPN肾小球血管病变进行精确分级将对该疾病的治疗方案选择和预后判断会有很大帮助。目前HSPN的分类仍然沿用1974年国际儿童肾病研究会(ISKDC)病理分级标准,该分类以肾小球系膜增生、新月体形成及膜增生性病变的大约程度为依据。尽管2003年中华医学会儿科学分会肾脏学组在此基础上对其稍作修改,即在Ⅲ级中除新月体病变外,加入肾小球节段性病变(硬化、粘连、血栓、坏死等),但以上方法仍然不能全面反映HSPN的肾小球血管病变程度,因为血管损害是HSPN的发生和进展的重要原因。因此ISKDC分类标准对预测HSPN的临床预后作用有限。进一步完善ISKDC分类,例如引入血管内皮细胞损害、炎性细胞浸润程度等重要分级参数,会有助于提升其病理分级准确性和提高临床预后判断能力。近年研究发现,Slit2/Robo1信号通路在调控血管炎症和血管新生中起着重要的作用。Slit2作为研究最热门的Slit蛋白,及其同源受体Robo1已经在人类肾小球、肾小管和肾间质中被检测到。活化Slit2/Robo1信号可以促进内皮细胞迁移和抑制趋化因子诱导的白细胞浸润、抑制血小板聚集、预防血栓形成。以往有研究提示在急进性肾小球肾炎炎症模型中,通过给予外源性Slit2可有效减少白细胞浸润、新月体形成和改善肾功能不全,这提示Slit2可能是一个血管炎症的抑制因子。我们前期通过研究已经发现了Slit2/Robo1信号通路参与糖尿病肾病的早期异常血管新生,但是否也参与HSPN肾脏的血管炎症和血管损伤后新生尚未见报道阐明。本研究首先通过收集HSPN患者临床数据资料和肾组织病理学标本,分析HSPN肾小球血管病变的病理学特征,建立HSPN肾小球血管病变百分比评分分级系统(GVLPS),探讨GVLPS分级与ISKDC病理分级的相关性,以及GVLPS分级与24h尿蛋白定量、肾小球滤过率(eGFR)、尿红细胞数和血清白蛋白(ALB)的关系,初步了解GVLPS评分系统的有效性。随后我们通过调查Slit2/Robo1信号蛋白在HSPN肾小球的定位和表达,以及HSPN肾小球中炎性细胞浸润(CD20阳性细胞和CD68阳性细胞)特点,分析Slit2/Robo1信号蛋白与炎性细胞浸润程度的关系,来明确Slit2/Robo1信号通路是否参与了紫癜性肾炎肾小球血管病变的发展,进而提出HSPN发生发展的新机制。研究方法:本课题研究方法包括两部分:第一部分:紫癜性肾炎肾小球血管病变病理分级的初步探讨。1.收集符合诊断HSPN标准,且患者具有典型的皮肤紫癜、血尿表现,病程少于1年的陆军军医大学附属新桥医院肾内科住院的140例患者肾活检标本及其临床资料。对照组为20例肾错构瘤切除或肾肿瘤切除术远离病灶的肾组织标本。2.肾组织标本进行HE、PAS和Masson染色及IgA、IgG、IgM、C3、C4、C1q免疫荧光染色,并制作标准电镜切片,分别用光学显微镜及透射电子显微镜观察所有肾标本的组织病理学特征。同时以目前国际上沿用的ISKDC分类标准进行分级。3.建立GVLPS(Glomerular Vascular Lesion Percentage Score)评分分级标准。GVLPS计算公式定义为:血管内皮细胞增殖、血管玻璃样变、血管纤维素样坏死、内皮下嗜复红物沉积、细胞新月体、纤维新月体、节段性硬化或球性硬化症的肾小球数量/全部被观察的肾小球数量×100%。按GVLPS值分为HG1至HG4共4个等级:GVLPS<25%为HG1,25%≤GVLPS<50%为HG2,50%≤GVLPS<75%为HG3,GVLPS≥75%为HG4。以20例正常肾组织标本作为对照。4.分析GVLPS分级与ISKDC分级、24小时尿蛋白、肾小球滤过率估算值(eGFR)、尿红细胞数和血清白蛋白(ALB)的相关性。第二部分:Slit2/Robo1信号通路与紫癜性肾炎肾小球血管病变的相关性研究。1.肾组织标本行Slit2、Robo1免疫组化染色,观察Slit2、Robo1在HSPN肾小球的定位和表达情况。2.肾组织标本行CD20、CD68免疫组化染色,观察炎性细胞CD20和CD68在HSPN肾小球的定位和表达情况。3.分析Slit2、Robo1表达与CD20~+、CD68~+数量的关系。研究结果:第一部分:1.自对照组至HG1、HG2、HG3、HG4组,患者实验室化验的血清肌酐、血尿素氮、24小时尿蛋白、尿红细胞水平均随HG级别增加逐渐升高;eGFR、ALB随HG级别增加逐渐降低。2.组织病理学检查提示HSPN肾小球主要血管病理损害类型为内皮细胞增殖、纤维素坏死、玻璃样变、内皮下嗜复红物沉积、细胞新月体、纤维新月体、节段性硬化、球硬化等,还可见IgA、IgM和补体C3于毛细血管壁和系膜沉积。并且每种类型的血管损害数量从HG1到HG4组均存在逐渐增多的变化。3.GVLPS分级与ISKDC分级呈正相关,并且GVLPS与24小时尿蛋白、尿红细胞数呈正相关,而与eGFR、ALB呈负相关。通过分析比较发现GVLPS分级能更好地反映血管损害程度,其疾病严重的警示作用较ISKDC分级增强。第二部分:1.免疫组化结果显示HSPN肾小球内均可见Slit2、Robo1的表达。Slit2主要表达在肾小球系膜细胞、内皮细胞和肾小管间质中,Robo1主要表达于肾小球内皮细胞和肾小管间质。与对照组相比,Slit2的表达从HG1到HG2组显著增加,HG3到HG4组表达逐渐降低,HG4组甚至低于对照组。Robo1在所有HG组中的表达均高于对照组。与Slit2表达相似,Robo1的表达从HG1到HG2组增加,而HG3到HG4组降低。2.分析CD20和CD68的免疫组化结果,发现对照组CD20~+和CD68~+细胞在肾小球、肾小管及肾间质表达稀少,而在HSPN组中CD20~+和CD68~+细胞主要表达在肾小球毛细管腔及系膜区,肾小球CD20~+和CD68~+细胞数量与对照组相比明显增加。CD20~+细胞数从HG1到HG3逐渐增加,与HG3相比,HG4的CD20~+细胞染色水平明显降低。与CD20~+细胞相似,CD68~+细胞数从HG1到HG3逐渐升高,但从HG3到HG4其数量明显下降。3.通过分析Slit2、Robo1表达与CD20~+、CD68~+细胞数的相关性,发现在GVLPS<25%范围(HG1),Slit2、Robo1表达与CD20~+、CD68~+细胞数分别呈正相关;在25%≤GVLPS<75%范围(HG2和HG3),Slit2、Robo1表达与CD20~+、CD68~+细胞数分别呈负相关;在GVLPS≥75%(HG4)时,Slit2和Robo1表达分别与CD20~+细胞和CD68~+细胞的相关性较低,提示了GVLPS分级仅与轻-中度肾小球血管病变的炎性细胞数相关性好,而肾小球血管损伤严重时相关性减弱。结论:1.GVLPS分级可以预警早期HSPN肾小球血管病变程度。2.GVLPS评分结合ISKDC分级可能会提高HSPN的病理诊断。3.Slit2/Robo1信号通路参与了HSPN肾小球血管病变的发展,活化Slit2/Robo1信号可能会有助于改善HSPN的炎性细胞浸润。