猪附红细胞体PCR诊断试剂盒的研制及应用

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wxws008
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
本实验以猪附红细胞体(Eperythrozoon suis)为研究对象,扩增了E.suis16SrRNA基因,研制了猪附红细胞体PCR诊断试剂盒,并应用该试剂盒对广东省的猪附红细胞体病进行了分子流行病学调查。 对姬姆萨染色初步确诊为E.suis感染的两份阳性血样,以文献报道的方法分离纯化E suis,抽提基因组DNA,使用能扩增大多数真细菌16S rRNA基因的通用引物fHf1/rHf2进行E.suis16S rRNA基因扩增,对扩增产物进行克隆、测序和序列分析。结果从两份E suis感染阳性血样中均成功地扩增出长度为1469 bp的核苷酸片段。将所获序列用BLAST程序与GenBank中收录的各种微生物序列进行比对分析,结果表明与国内报道的E suis广东株和国外报道的E suis Illinois株、Zachary株16S rRNA基因序列高度相似。运用DNASTAR5.0软件的多序列比对程序,将本次所测得的序列与Genbank中所收录的猪和其他动物的附红细胞体、血巴尔通氏体的16S rRNA基因序列进行比对,结果表明两个样品所获得的序列与E.suis广东株之间的相似性分别为99.7%和99.5%。而两个样品和E. suis Illinois株以及E. suisZachary株之间的相似性均在95%左右,进一步表明了广东所流行的E suis与国外报道的E. suis具有一定的遗传差异。 根据实验所得的E. suis 16S rRNA基因的序列,设计合成种特异性引物,以E.suis 16S rRNA基因的重组质粒作为阳性参照,通过对PCR反应条件的优化,研制了猪附红细胞体PCR诊断试剂盒。试剂盒由以下各部分组成:PCR反应液10管,每管22.75μl;琼脂糖1.0g;EB(10μg/μl)50μl;6×loading buffer 50μl.rTaq酶(5U/μl)5μl;阳性对照一支,20μl。其中PCR反应液主要包括10×PCR Buffer,终浓度为4mmol/L的MgCl<,2>,终浓度为50mmol/L的引物P1/P2和终浓度为200μlmol/L dNTPs。分别对该试剂盒的特异性,敏感性,重复性,稳定性和保存期进行了系统的研究。在特异性实验中仅E.suis基因组DNA能扩增出约为419bp的特定片段,而对猪丹毒丝菌、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、鸡毒支原体和猫血巴尔通氏体的基因组DNA没有扩增带出现;试剂盒对模板DNA的最低检出量是0.23fg;反复冻融50次对试剂盒的检测结果没有影响,试剂盒在-20℃的保存期至少在9个月以上,具有良好的稳定性;重复性实验中4个不同批次的试剂盒对7份E suis阳性样品均能扩增出明亮的目的条带,而对10份阴性样品的PCR扩增结果全为阴性。上述实验结果证明该试剂盒的各项指标基本达到了猪附红细胞体PCR检测的要求。应用该试剂盒对广东省佛山地区的208份临床病猪血样和从广州某屠宰场采集的117份临床健康猪血样进行了猪附红细胞体感染情况的检测,其中8份临床病猪血样和1份临床健康猪血样的检测结果为阳性。检测结果显示该试剂盒具有特异性强、准确性高、操作方便、快速,结果判断直观等特点,适用于猪附红细胞体病的临床检测和流行病学调查,对猪附红细胞体病的诊断与防治具有重要的意义。
其他文献
在我们的生活中,危机随时存在,不经意间他会一触即发,影响我们生活工作的正常秩序.大学是年轻人梦想的发源地,但同时也是一个小社会,由于社会的影响,这里也是危机发生频率高
期刊
市场营销课程已经是很多院校开设的一门与经济统计管理相关的专业课程,在技工学校市场营销管理对教学要求有较强的实用性,因此显得颇为重要.
现代网络技术的出现,丰富了课堂的教学手段和教学内容,在化学课堂中,多媒体的出现可以有助于提高老师的备课效率、激发学生的兴趣、拓展教学内容.针对多媒体教学中存在的问题
现今,肩负着培养一线技术技能型人才使命的职业教育迎来了发展的重要契机,而职教师资队伍的建设水平则直接关系到了职业教育能否稳定、快速的发展.美国社区学院是美国高等教
We are reporting 3 cases of pediatric endobronchialtumors presented with recurrent pneumonia. The median age of patients, at time of presentation, was 10.6 year
网络的高速发展广泛而深刻地影响了当代大学生的生活方式.大学生骨干在高校学生日常管理中起着重要作用.高校思想教育工作者应结合时代特色和当代大学生骨干特点,有针对性地
随着国民经济的不断发展,全民族对教育特别是高等教育有了前所未有的重视.而高校的辅导员作为象牙塔中的日常生活、学习、精神、思想等方面的引导者,他们的业务水平直接关系
期刊
根据已发表的禽脑脊髓炎病毒1143株特异性结构蛋白VP0、VP1、VP3基因序列,分别设计三对引物,利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,在体外从AEVVan-Roekel株感染的SPF鸡胚
高校是知识传播的重要场所,肩负着的社会使命;想要提高高校的教育质量,必须要配备高水平的师资力量团队;因此应加强高校人力资源管理机制的建立.高校人力资源管理的混乱会影
该文通过给人工造成的免疫功能低下的小鼠模型和正常的小鼠灌喂黄芪、淫羊霍煎剂,对黄芪、淫羊霍煎剂与小鼠免疫功能的关系进行了量效与时效实验,在量效关系实验中,给免疫功