贵州地方稻种来拢黄叶突变体yl1基因定位及克隆研究

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叶色突变体在叶绿素合成与代谢、光合作用过程等研究中有着重要的价值,还可在杂种优势中作为筛选标记加以利用。本研究从贵州地方稻种来拢EMS突变体库中筛选获得的黄叶突变体yl1为材料,对其三个生育期叶绿素含量、苗期叶绿素合成前体物质含量、叶绿素合成代谢相关基因表达和叶绿体发育相关基因表达进行分析,探究yl1突变体表型特性。并通过MutMap技术对突变基因进行精细定位。取得以下结果:1 yl1突变体表型及突变特性分析对黄叶突变体yl1及野生型苗期、分蘖期及灌浆期叶绿素含量进行测定,发现yl1光合色素在三个生育期均显著低于野生型。但yl1叶绿素a/b比值在苗期比野生型高,分蘖期差异不显著,而灌浆期却比野生型低。对突变体及野生型叶片中叶绿素合成前体物质进行测定。发现在胆色素原(PBG)到原卟啉Ⅸ(ProtoⅨ)的三个阶段,yl1突变体前体物质含量均高于野生型,从原卟啉Ⅸ(ProtoⅨ)合成及其之后所有阶段的前体物质含量均显著低于野生型。并且yl1突变体中编码ProtoⅨ合成Mg-ProxoⅨ关键酶镁螯合酶D亚基的CHLD基因表达量显著下降,Mg-ProxoⅨ合成之后途径的合成酶编码基因表达量均下降。说明yl1黄叶性状是由于编码镁螯合酶D亚基的CHLD表达量降低,导致ProtoⅨ合成Mg-ProxoⅨ受到影响,导致yl1叶绿素合成减少。通过对yl1突变体及野生型叶片的超微结构观察发现,突变体中叶绿体边界不明显,基质片层呈现不同程度的松散。同时,编码叶绿体发育第一阶段中关键基因Ftsz的表达量也显著低于野生型,而后两个发育阶段中关键酶基因表达量无明显变化,推测yl1突变体叶绿体发育第一阶段基因下调导致叶绿体发育受到影响。2 yl1基因精细定位及候选基因筛选以yl1与来拢野生型回交F2为定位群体,利用MutMap技术对yl1进行基因定位研究。对F2群体中的黄叶及正常叶色后代进行重测序及SNP位点分析。获得两个位于第三号染色体上的候选基因,编码多糖合成关键酶尿苷6葡萄糖脱氢酶LOCOs03g31210和功能未知的LOCOs03g36760。分别对野生型与yl1的20株植株进行DNA提取,测序验证发现,其中LOCOs03g31210第1432位碱基(位于第二个外显子上)由C突变为T,从而导致第478位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。而LOCOs03g36760第二个外显子上第2717碱基由A突变为G,导致第906位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酸。3 yl1候选基因功能验证分别构建以pCambia1301质粒为基本载体,以人工合成35S启动子驱动LOCOs03g31210与LOCOs03g36760基因,10kDa醇溶蛋白终止序列为终止子的植物超量表达载体pCam-35S-YL1-1和pCam-35S-YL1-2。利用农杆菌介导水稻茎尖的方法将两个基因超量表达载体遗传转化yl1突变体,对yl1侯选基因进行验证。结果表明,转LOCOs03g31210基因的yl1植株叶色并未转绿,而转LOCOs03g36760基因的植株叶色出现叶色恢复为野生型表型。因此我们认为,LOCOs03g36760可能是导致yl1黄叶突变体叶色变黄的关键基因。
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