睫状神经营养因子对谷氨酸离子型受体引起的海马神经元内钙离子浓度升高的快速调节青岛大学医学院病理生理学专业九八级硕士研究生：吴 飏 飏导 师：崔 瑞 耀 教授睫状神经营养因子（Ciliary Neurotrophic Factor; CNTF）是从鸡胚睫状神经节中提取的一种神经活性蛋白。它是与IL-6，IL-11等具有同源性的细胞因子。CNTF具有多种生物学功能:如促进前体神经元生长、分化和成熟;维持各种神经元存活;促进损伤神经元修复;阻止神经元的退行性变化;保护神经胶质细胞和保护神经元免受应激性损伤等作用。以往对CNTF生物作用的机制研究集中在基因组途径，认为它是通过与膜上的CNTFα亚基结合后再与细胞膜上的gp130亚基和LIFRβ结合在一起，所形成的受体复合物再激活膜内侧的JAK/TYK激酶，从而使下游的信号蛋白发生酪氨酸磷酸化，导致STAT3和STAT88/89被激活，进入细胞核，与脱氧核糖核酸的STAT91结合序列区结合，调控细胞核内的基因转录和蛋白质合成，进一步实现多种生物学功能。最近报道，CNTF能够在神经肌肉接头处发生快速调节作用； CNTF能够快速地抑制Glu引起的原代培养的海马神经元细胞内Ca2+浓度 （[Ca2+]i）升高。这种快速的作用从时间上讲不可能是通过基因组途径完成的，故考虑CNTF的作用机制中可能还存在其它的途径。本实验以原代培养的海马神经元为研究对象，用Ca2+图像分析系统，和Grynkiewicz描述的双波长荧光成像原理测定细胞内Ca2+浓度（[Ca2+]）的方法，测定不同情况下细胞内Ca2+浓度变化，分析CNTF快速作用的机制。本实验研究的主要结果如下：1、 <WP=4>原代培养的不同培龄的海马神经元2、 两种Glu离子型受体激动剂作用于海马神经元引起的细胞内[Ca2+]的变化2.1 在0~115μM浓度范围内，AMPA剂量依赖地引起原代培养的海马神经元 [Ca2+]i升高，浓度效应曲线呈S型。AMPA作用的最适浓度为2.3μM，反映细胞内[Ca2+]高低的指标—Ratio值约为0.80±0.14。2.2 在0~1000μM浓度范围内，NMDA剂量依赖地引起原代培养的海马神经元 [Ca2+]i升高，浓度效应曲线呈S型。NMDA作用的最适浓度为100μM，反映细胞内[Ca2+]高低的指标—Ratio值约为1.27±0.26。3、 CNTF（1μg/ml；10μg/ml）单独作用于静息状态下的原代海马神经元，不会引起细胞内[Ca2+]变化。4、 CNTF（1μg/ml；10μg/ml；50μg/ml）孵育原代培养的海马神经元5分钟，NMDA（100μM）,AMPA(2.3μM)引起的海马神经元 [Ca2+]i升高。4.1 CNTF（1μg/ml；10μg/ml；50μg/ml）孵育5分钟后，2.3μM的AMPA作用引起的海马神经元的[Ca2+]i的升高与未用CNTF孵育的实验结果比较没有明显改变（P>0.05）。4.2 CNTF（1μg/ml；10μg/ml；50μg/ml）孵育5分钟后，100μM的NMDA作用引起的海马神经元 [Ca2+]i升高与未用CNTF孵育的实验结果比有所降低，差别有统计学意义（P<0.05）。5、 10μg/ml CNTF孵育3分钟，也能够抑制100μM NMDA引起的原代海马神经元 [Ca2+]升高。<WP=5>6、 100ng/ml PTX孵育24小时，CNTF的上述抑制作用消失。从上述结果看出，CNTF具有快速抑制Glu引起的原代培养的海马神经元 [Ca2+]i升高的作用，这种作用主要是通过与Glu离子型受体NMDA相互作用而发生的，Glu离子型受体AMPA似乎在CNTF的快速作用中无效。CNTF的快速作用可能与G蛋白偶连有关，这种快速作用发生于CNTF基因组信号传导途径的上游，对基因组途径起调节作用。