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冠心病(coronary heart disease,CHD)是目前临床上最常见的威胁人类健康的疾病之一,随着病情的发展最终可发展为心力衰竭。其中心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是由于相应的冠脉病变引起其供应的心肌组织缺血缺氧,心肌组织坏死,是一种严重的缺血性心脏病(Ischemic heart disease,IHD)。虽然目前临床患者急性心肌梗死发生后能够及时通过药物溶栓、经皮冠脉内支架植入术(PTCA)及冠脉旁路移植术(CABG)在急性心肌梗死早期开通闭塞血管,再通血液灌注改善心肌缺血。然而对于在血液再灌注治疗前已经发生缺血坏死的心肌细胞不能再生,因此这类治疗方法并不能使已经发生坏死的心肌组织部分的功能得到改善。心肌梗死区逐渐被纤维瘢痕组织代替,失去正常的收缩功能,随着心脏的重构过程的发展最终不可逆转的演变成梗死后的心力衰竭阶段。目前治疗IHD的手段有很多,而干细胞移植治疗技术是近年来新兴治疗手段之一。在动物及临床实验研究中大量数据已表明,骨髓来源的干细胞能够向心肌样细胞、血管内皮样细胞及平滑肌样细胞等分化,并具有旁分泌功能促进心肌组织内血管的新生,不同程度的抑制纤维化形成,从而改善心功能。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是干细胞移植治疗中最为常用的干细胞。而目前研究表明急性心肌梗死后MSCs移植治疗最佳治疗时间窗是在心肌梗死早期阶段(心梗后的第3～7天左右),而在心肌梗死的后期阶段由于心肌内微环境中促归巢因子表达水平显著降低、纤维瘢痕组织已经形成等不利于干细胞的迁移、定居及分化,此时给予干细胞治疗效果不佳甚至无效。有研究表明,超声破坏微泡后产生的空化效应能够使细胞膜通透性增加,血管内皮间隙增宽,且能够刺激组织内环境中促血管新生的细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)等表达增多。超声破坏微泡对心肌组织内环境的影响有助于干细胞的进一步动员及归巢。因此本研究,初步探讨在大鼠心肌梗死的后期通过不同机械指数的诊断超声辐照微泡对心肌组织内环境的影响,选择一个适宜的干细胞移植治疗超声条件。并在适宜的诊断超声条件下辐照微泡改变大鼠心梗后期心肌组织内的微环境,探讨干细胞的归巢效果,并评价其治疗效果。第一部分wistar大鼠骨髓源性MSCs的分离、培养、鉴定及标记目的探讨大鼠MSCs的分离、纯化、鉴定及标记方法采用贴壁细胞分离法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),用含10%的胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,细胞生长融合80%时,用0.25%的胰蛋白酶消化细胞,经行传代培养。选取第3至5代细胞通过细胞流式仪检测细胞表面分子标记物CD45,CD34,CD44,CD90和CD29及成脂、成骨诱导分化。DAPI荧光标记MSCs。结果培养贴壁的MSCs呈长梭形、多角形生长;随着传代培养次数的增加MSCs逐渐得到纯化。MSCs增殖活跃,传代后细胞生长速度快,第7左右达到生长高峰。分离的大鼠MSCs表面CD45和CD34呈阳性表达,而CD44,CD90和CD29呈阴性表达。成脂诱导培养后油红O染色细胞胞浆内有大量脂滴形成,成骨诱导分化后碱性磷酸酶染色可见细胞内骨性颗粒存在。结论贴壁细胞培养法分离骨髓单个核细胞,经培养、传代后可以获得较高纯度的MSCs,为治疗大鼠心肌梗死提供良好的细胞来源。第二部分wistar大鼠心肌梗死模型的建立与评价目的成功建立大鼠心肌梗死模型,为下一步实验奠定基础。方法(1)选取体重为220g～250g的wistar大鼠,称重后用配好的3%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射麻醉,采用气管插管法,连接小型动物呼吸机,调整潮气量6ml,频率80次/min。左胸第4肋间处打开胸腔,用胸腔撑开器撑开胸壁,剪开心包膜,暴露心脏。结扎左冠状动脉前降支,结扎后可观察到结扎血管以下心室前壁心肌颜色变苍白,收缩力减弱,心电图检查见导联ST段抬高表示结扎成功。结扎45min后,剪短结扎线,使结扎血管再通,待大鼠生命体征稳定后,逐层缝合关胸。(2)M型超声评价心梗后心功能,HE染色、Masson染色观察心梗后病理变化。结果建模后的大鼠经M型超声显示左心室收缩功能减退,HE染色和Masson染色显示左室前壁大量心肌细胞坏死及纤维瘢痕化形成。结论左前降支冠脉结扎法可成功建立稳定的大鼠MI模型。第三部分不同强度超声破坏微泡对大鼠心梗后期微环境变化的影响目的探讨不同强度的诊断超声联合微泡对心梗后期大鼠心肌内微环境的影响,以确定利于MSCs移植治疗的适宜超声能量。方法在成功建立心肌梗死大鼠模型14天后,随机分为诊断超声机械指数=0.4、0.6、1.0、1.6和1.9五组。第1组经尾静脉1Omin内缓慢注射1ml微泡造影剂,诊断超声仪采用时间触发模式,触发脉冲持续时间30s,触发间隔时间2s,机械指数=0.4,作用时间10min,超声探头固定于大鼠心脏乳头肌短轴观。第2组采用超声机械指数=0.6,第3组采用超声机械指数=1.0,第4组采用超声机械指数=1.6,第5组采用超声机械指数=1.9,其余条件均同第1组。每组3只。对照组为心肌梗死14天后大鼠3只(无超声干预)。在超声干预24h后取材通过Western Blot检测SDF-1、VCAM-1、VEGF的蛋白质表达水平。结果Western Blot结果显示采用超声机械指数=1.0、1.6、1.9的超声辐照心肌组织中SDF-1、VEGF、VCAM-1明显比超声机械指数=0.4、0.6及对照组增高(约2～3倍),且差异具有统计学意义。而超声机械指数=1.0、1.6、1.9组间比较无明显统计学差异。超声机械指数=0.4、0.6与对照组之间比较无统计学意义。结论采用诊断超声机械指数=1.0、1.6和1.9靶向破坏微泡能够显著改善心内微环境,理论上为干细胞归巢、分化提供了一个良好的环境。第四部分诊断超声联合微泡促进大鼠心梗后期MSCs归巢的研究目的探讨诊断超声联合微泡促进大鼠心肌梗死后期MSCs移植改善心功能的有效性方法(1)用DAPI标记MSCs,移植72h后观察在静脉移植DAPI-MSCs组与超声+微泡+DAPI-MSCss组心肌组织内荧光细胞分布及阳性细胞计数。(2)MSCs移植治疗4周后对各组(PBS组、超声+微泡组、MSCs组、超声+微泡+MSCs组)采用M型超声检测左心室功能、Masson染色检测心肌胶原纤维的形成,并计算胶原面积。结果(1)DAPI标记的MSCs在荧光显微镜紫外色荧光下呈蓝色。从DAPI-MSCs移植大鼠的心脏冰冻切片结果显示,DAPI-MSCs组和超声+微泡+DAPI-MSCs组荧光显微镜下心肌梗死区均可以看到蓝色的荧光细胞。而超声+微泡+DAPI-MSCs组心肌组织中蓝色荧光细胞密度均明显高于单纯DAPI-MSCs组。通过对DAPI-MSCs组和超声+微泡+DAPI-MSCs组心肌梗死区蓝色荧光细胞计数并进行统计学分析。DAPI-MSCs组平均有55±24个,而超声+微泡+DAPI-MSCs组平均有133±38个,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)(2)M型超声检测MSCs组(27.77±3.31%)和超声+微泡+MSCs组(32.05±3.85%)左心室短轴缩短率(FS%)与PBS组(23.40±4.15%)和超声+微泡组(22.67±2.82%)比较,差异有统计学意义,P<0.05。而MSCs组和超声+微泡+MSCs组FS%之间差异也具有统计学意义,P<0.05。(3)PBS组和超声+微泡组左心室梗死区纤维化面积比MSCs组和超声+微泡+MSCs组明显增大。而MSCs组与超声+微泡+MSCs组之间心肌梗死纤维化程度相似。通过对心室梗死区纤维化面积统计学分析表明,超声+微泡+MSCs组与PBS组和超声+微泡组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。而在MSCs组与PBS组和超声+微泡组之间无明显统计学差异.结论诊断超声靶向微泡诱导心肌梗死后期微环境改变促进了干细胞移植及心功能的改善,再次干细胞移植提供了一个好的机会。