目的：在中医整体观思想指导下,采用药物靶标预测、网络分析和实验验证相结合的方法,探讨桂枝芍药知母汤(GSZD)治疗类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的潜在分子机制,为临床合理用药提供理论支撑和实验依据,也为进一步新药研发及同类复方的研究提供方法学参考。方法：1.GSZD所含化学成分的候选靶标预测1.1从台湾中医药资料库TCM Database@Taiwan收集GSZD所含化学成分的二级结构信息。1.2基于结构相似性原理,利用Therapeutic Targets Database中的Drug similarity search工具,获得与上述复方所含化学成分具有相似化学结构的已知药物分子(结构相似度标准:similar～very similar, similar score>0.85),并将其作为GSZD所含化学成分的候选靶标分子。2. GSZD所含中药-候选靶标-RA相关分子网络分析2.1已知抗RA靶标分子的收集和整理在DrugBank数据库、OMIM数据库、GAD数据库和KEGG通路数据库中进行已知抗RA靶标分子的收集。2.2蛋白质相互作用信息的收集和整理蛋白质相互作用信息来源于八个现有的蛋白质相互作用数据库,分别为Human Annotated and Predicted Protein Interaction Database (HAPPI)、 Reactome、 Online Predicted Human Interaction Database (OPHID)、InAct、Human Protein Reference Database(HPRD)、Molecular interaction Database (MINT)、Database of Interacting Proteins (DIP)和PDZBase。2.3 GSZD所含中药-候选靶标分子网络的建立和分析2.3.1基于GSZD所含中药及其对应候选靶标分子的相互作用,建立“GSZD所含中药-候选靶标分子网络”2.3.2通过共模块化分析,将上述网络划分为三个功能模块,并依据模块内分子所参与的通路信息,获得每个模块的生物学功能及其与RA病理环节的相关性。2.4 GSZD-候选靶标-RA相关分子网络的建立和分析2.4.1基于GSZD所含中药及其对应候选靶标分子的相互作用和候选药物靶标与已知抗RA靶标分子的相互作用,建立"GSZD所含中药-候选靶标-RA相关分子网络”;2.4.2网络拓扑特征值的计算(1)计算每个节点的四个网络拓扑特征值即连接度、节点介度、节点紧密度和K core值；(2)筛选连接度大于所有节点连接度中位数两倍的节点,为网络中的hub节点,并构建其直接相互作用网络；(3)通过计算上述四个拓扑特征值,并选取其值大于相应中位数的节点为关键hub节点；(4)计算hub节点直接相互作用网络中每条边的边介度值,筛选网络中发挥重要媒介作用的相互作用对,即与GSZD矫正RA失衡网络密切相关的作用靶标信号轴,并设计体内、外多层次实验进行验证。3.整体实验3.1关节炎模型的建立选用健康雄性Lewis大鼠,6-7周龄,体重180-220 g,尾根单次皮内注射0.1 ml/只完全弗式佐剂,建立佐剂诱导性关节炎(Adjuvant-Induced Arthritis, AIA)模型。3.2动物分组、给药和取材雄性Lewis大鼠48只,取材时间点为造模后第21天,每组8只随机分为6个组,组别如下：正常组,AIA组,低、中、高剂量GSZD治疗组,甲氨喋呤(MTX)治疗组。GSZD三个剂量为4.65,9.30,18.60 g/kg(分别相当于临床0.5倍、1倍、2倍等效剂量),甲氨喋呤剂量02mg/kg(相当于临床等倍剂量)。从造模当天开始给药,GSZD连续给药,甲氨蝶呤每给药3天,间歇1天。第21天处死动物,取关节组织固定或放置低温冰箱备用,分别用于后续的组织病理学检测及蛋白印迹反应。3.3关节炎评价3.3.1关节炎严重程度评价及时观察并记录各组大鼠临床红肿症状,采用双盲法评价疾病的严重程度,包括临床积分、关节炎发病率、肢体累计率、首次发病时间四个指标。临床积分参照Cheryl L方法即四肢的总分(总分最多80分),踝关节大于1分或者掌关节大于1分算发病；发病率即发病数量与本组总数的比值；肢体累计率即发病肢体数与本组大鼠的总肢体数比值；起始发病时间即首次观察到关节炎临床症状的时间。3.3.2关节炎大鼠受损组织的病理变化采用HE染色法和甲苯胺蓝染色法对取材后的大鼠受损关节组织(踝关节)进行染色,镜下观察各组大鼠踝关节的病理变化,观察大鼠滑膜炎症、软骨损伤及骨破坏情况并采用双盲法计分。3.3.3炎症相关指标的检测采用western blot方法检测取材后的大鼠受损踝关节中HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-a信号轴中五个蛋白质分子的表达情况,并利用软件进行数据分析。4.体外细胞实验4.1细胞培养选用RA患者成纤维滑膜细胞(HFLS-RA),使用滑膜细胞专用培养基(CellApplications公司,USA)加100 U/mL青霉素,80 U/mL链霉素,2 mM谷氨酰胺及10%专用生长因子,在37℃、5%CO2、95%空气的培养箱里培养,实验所用细胞均为状态良好的第4-8代细胞。4.2细胞诱导及药物干预细胞长到约为80%时可用,除正常对照组外,其余组别的细胞均用10ng/mL白介素(IL-1β)诱导24 h产生炎性因子。除正常组和诱导对照组外,其他组分别加入不同浓度的GSZD (5.12×10-5,2.56×10-4,1.28×10-3 μg/mL)。4.3炎症相关指标检测体外培养的HFLS-RA给予不同干预条件后,采用western blot方法检测HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-a信号轴中五个蛋白质分子的表达情况,并利用软件进行统计分析。结果：1. GSZD所含化学成分的候选靶标谱从台湾中医药资料库TCM Database@Taiwan收集得到165个GSZD所含化学成分的二级结构,基于结构相似性原理预测得到该复方的77个候选靶标,其中有15个是已知抗RA药物、自身免疫性疾病治疗药物、以及镇痛药物的靶标分子。2. GSZD所含中药-候选靶标-RA相关分子网络分析2.1共收集得到208个已知RA治疗靶点；2.2 GSZD所含中药-候选靶标分子网络的建立和分析基于GSZD所含中药及其对应候选靶标分子的相互作用,建立“GSZD所含中药-候选靶标分子网络”。通过共模块化分析,该网络被划分为三个模块,分别以桂枝、芍药、知母为中心,其中第一个模块以桂枝为中心,主要参与炎症反应、细胞因子合成及刺激反应、补体和凝血级联反应相关的信号通路有关；第二个模块以芍药为中心,主要与药物代谢和降低药物毒性有关；第三个模块以知母为中心,与细胞膜受体介导的信号转导和G-蛋白信号转导有关。2.3GSZD所含中药-候选靶标-RA相关分子网络(1)筛选到GSZD候选靶标-已知抗RA靶标相互作用网络中的135个hub节点;(2)根据通路富集分析结果显示,这些hub节点通过参与T细胞和B细胞受体通路、Toll-like受体通路、破骨细胞分化、NF-kappa B信号通路、TNF信号通路、趋化因子通路、VEGF通路和神经反应性配体和受体相互作用,进而影响到RA进展中的主要病理学改变如炎症、滑膜血管翳形成、炎细胞浸润、血管新生、关节损伤和疼痛；(3)通过网络拓扑特征值的计算,筛选到40个关键hub节点,其中有10个为GSZD的关键候选靶标；(4)通过计算上述网络中每条边的边介度值,发现H DAC1-HSP90AA1相互作用对的边介度值最高(edge-betweenness=128.25),说明该相互作用对在网络中发挥重要的媒介作用；(5)发现有三个已知抗RA靶标(NFKB2、IKBKB和TNF-α)与HDAC1-HSP90AA1发生直接相互作用,并形成HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信号轴;(6)进一步功能挖掘结果显示,HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α 信号轴主要参与抗原呈递、T细胞和B细胞受体信号通路、T(?)lll-like受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、破骨细胞分化、NF-kappa B信号通路和TNF信号通路。网络分析结果提示GSZD可能通过调控HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信号轴来矫正RA病程中失衡的“炎症-免疫分子网络”。3.整体实验验证3.1 GSZD能缓解AIA大鼠的关节炎严重程度肉眼观察AIA模型组的大鼠临床红肿、畸形症状明显,数据统计表明,AIA模型组的大鼠发病率为100%,临床积分最高35分,平均首次发病时间为造模后第11天,肢体累计率为52%。GSZD给药后可显著改善AIA大鼠关节炎严重程度,体现在降低关节临床积分、发病率、肢体累计率,延长首次发病时间。3.2 GSZD对AIA大鼠关节组织病理学的改善作用HE染色和甲苯胺蓝染色显示,AIA模型组的大鼠关节腔内出现炎性细胞浸润现象,滑膜增生明显,软骨损伤和骨损坏明显。GSZD可降低AIA大鼠关节炎评分、软骨破坏评分及骨破坏评分。3.3 GSZD对HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信号轴的调控作用western blot方法检测表明,与正常组相比,AIA模型组的大鼠受损踝关节组织中HDAC1, HSP90AA1, NFKB2, IKBKB及TNF-α五种蛋白的表达均异常升高,GSZD能有效降低AIA大鼠踝关节中上述五种蛋白质的表达水平。4.体外细胞实验验证western blot方法检测表明,与空白对照组相比,IL-1p诱导的HFLS-RA中HDAC1, HSP90AA1, NFKB2, IKBKB及TNF-α的蛋白表达均上调,GSZD能有效降低这五种蛋白的表达。结论：本研究基于网络药理学研究策略,整合药物靶标预测、网络分析和实验验证的方法,阐释GSZD治疗RA的作用机制。实验结果表明,GSZD具有改善RA病情、减轻RA症状的作用,其作用机制可能是通过调控HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信号轴来矫正RA进展中失衡的“炎症-免疫分子网络”。此项研究为GSZD在临床治疗RA中的合理运用提供了实验依据,也为新药研发及其他同类中药复方的研究奠定了方法学基础。