目的：探索芍药苷(PF)促血管新生活性及其作用机制。方法：为了明确芍药苷的促血管新生活性及其作用机制,我们分别在转基因斑马鱼、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上进行了研究。1.芍药苷对斑马鱼的促血管新生作用。1)g(fli-1:EGFP)y1斑马鱼血管缺陷模型。试验使用血管内皮生长因子受体(VEGFR)酪氨酸激酶抑制剂Ⅱ(VRI)来处理受精后小时数(hpf)为24 h的Tg(fli-1:EGFP)y1斑马鱼胚胎建立血管缺陷模型,后给予芍药苷干预。斑马鱼背部纵向血管(DLAV)、节间血管(ISV)的生长状况被作为评估芍药苷的促血管新生作用的参考指标。2) Tg(fli-1:EGFP)y1、Tg(fli-1:nEGFP)y7斑马鱼肠下静脉(SIV)血管新生模型。使用24 hpf的Tg(fli-1:EGFP)y1、Tg(fli-1:nEGFP)y7斑马鱼胚胎,分别给予25μM-100μM芍药苷处理,48 h后于荧光显微镜下观察。计数Tg(fli-1:EGFP)y1斑马鱼的SIV出芽条数,以及Tg(fli-1:nEGFP)y7斑马鱼SIV内皮细胞个数,作为芍药苷促血管新生作用的参考指标。3)芍药苷对斑马鱼头部血管的影响。使用内皮细胞绿色荧光蛋白&红细胞红色荧光蛋白双转基因Tg(fli-1:EGFP;GATA-1:DsRED)斑马鱼,先给予VRI (300 ng/ml,3 h)处理造成血管缺陷模型,后给予100μM芍药苷处理,24 h后于荧光显微镜下观察。4)芍药苷对斑马鱼血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)基因表达的影响。使用不同浓度(6.25μM-100μM)芍药苷处理24 hpf斑马鱼6 h。提取总RNA,反转录cDNA,并行实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR),检测VEGFa、VEGFc、FGF1、bFGF、EGF基因的表达。5)芍药苷对斑马鱼类fms酪氨酸激酶-1(flt-1)、激酶插入区受体(kdr)、激酶插入区样受体(kdr)、血管性血友病因子(vWF)基因表达的影响。给予斑马鱼VRI预处理,后给予不同浓度(25 μM-100μM)芍药苷处理6 h。随后收集斑马鱼,提取总RNA,反转录为cDNA,行实时定量PCR,检测芍药苷对flt-1、kdr、kdrl、vWF基因表达的影响。2.为了解芍药苷对内皮细胞的促血管新生作用,我们分别检测了芍药苷对HUVECs增殖、迁移、成管的影响。1)芍药苷对HUVECs增殖的影响。四甲基偶氮唑盐(MTT)试验：为检验芍药苷对HUVECs增殖及活性的影响,使用不同浓度(0.001、0.003、0.01、0.03μM)芍药苷处理HUVECs 30 h。后加入一定浓度MTT处理4 h后,于酶标仪下检测,以光密度(OD)值作为反映细胞活性及数量的参考指标。Hoechst染色：为检测芍药苷在体外的促血管新生活性,我们进一步用Hoechst染色法检测其对HUVECs增值的影响。用不同浓度(0.001、0.003、0.01、0.03 pM)芍药苷处理HUVECs 30 h。随后用10μg/ml Hoechst 33258染色HUVECs 15 min,显微镜拍照并定量细胞个数。2)芍药苷对HUVECs迁移的影响。划痕试验：将HUVECs种于48孔板,经过孔的中心做划痕,后给予不同浓度(0.3、1.0、10μM)芍药苷处理10 h。以划痕的原始宽度减去最终宽度即为细胞迁移的距离。xCELLigence RTCA DP实时监测HUVECs迁移：为研究芍药苷的促血管新生活性,利用xCELLigence RTCA DP系统实时监测芍药苷对HUVECs迁移能力的影响。用不同浓度(0.1、1.0、10μM)芍药苷干预HUVECs 8h。每间隔15 min记录细胞迁移情况,以相应的细胞指数变化做为评价细胞迁移功能的参考指标。3)芍药苷对HUVECs成管的影响。为明确芍药苷促血管新生活性,用不同浓度(0.3、1.0、10μM)芍药苷处理HUVECs,观察其对HUVECs成管的影响。以每个孔三个随机视野的分支点数作为评价管状结构形成能力的参考。3.为明确芍药苷发挥促血管新生作用的靶点,我们探究了腺苷A1受体在芍药苷促血管新生中的作用。1)腺苷A1受体在芍药苷促斑马鱼SIV血管新生中的作用。为验证腺苷A1受体在芍药苷促斑马鱼SIV血管新生中的作用,我们给予24 hpf斑马鱼腺苷A1受体特异性抑制剂8-环戊基-1,3-二丙基黄嘌呤(DPCPX)(3μM)与芍药苷(50μM)共处理48 h,后于荧光显微镜下观察SIV出芽情况。2)腺苷Al受体在芍药苷诱导斑马鱼血管生长缺陷模型血管新生中的作用。为验证腺苷A1受体在芍药苷诱导斑马鱼血管生长缺陷模型血管新生中的作用,我们给予血管生长缺陷模型斑马鱼DPCPX(3 pM)与芍药苷(50 μM)共处理24 h,后于荧光显微镜下观察ISVs生长情况。为进一步验证芍药苷是否通过增加内源性腺苷的生成或抑制腺苷转运而间接的促进了血管新生,我们进行了胞外-5’核苷酸酶活性试验及腺苷摄取试验。3)芍药苷对胞外-5’核苷酸酶的作用。将HUVECs用不同浓度(0.001、0.01、0.1、1.0、10μM)芍药苷处理24 h。加入缓冲液,孵育后终止反应,加入钼酸铵,再次孵育后,生成有色物质,于750 nm处测定吸光值。以无机磷酸盐生成物的量代表胞外-5’核苷酸酶的活性。4)芍药苷对腺苷摄取的干预作用。为检测HUVECs对腺苷的摄取,室温下,将300μl含[3H]腺苷(10μM,2μCi/mL)的HEPES缓冲液加入到细胞上,同时给予不同浓度(0.001、0.01、0.1、1.0、10 gM)芍药苷干预,静置4 min。为检测腺苷的被动摄取,将单层的HUVECs与含[3H]腺苷的0.5 mM的硝基苯硫嘌呤核苷(可以阻滞细胞对腺苷的摄取)共孵育。用冰PBS缓冲液冲洗HUVECs,将摄取过程终止。将24孔板晾干,并加入500 μl 5%的Triton-X以裂解细胞,静置过夜。细胞裂解液中加入2 ml闪烁液,用p-闪烁计数器记录其放射性。结果：芍药苷对斑马鱼及HUVECs的促血管新生活性及作用机制的研究结果如下。1.芍药苷对斑马鱼的促血管新生作用。1) Tg(fli-l:EGFP)yl斑马鱼血管缺陷模型。未经VRI处理的斑马鱼DLAV、ISVs均生长完整,VRI300 ng/ml处理3h显著抑制了ISVs、DLAV生长,而不同浓度(6.25μM-100μM)芍药苷处理24 h呈剂量依赖性的促进了ISVs、DLAV生长。2) Tg(fli-1:EGFP)yl、Tg(fli-1:nEGFP)y7斑马鱼SIV血管新生模型。芍药苷可促进Tg(fli-1:EGFP)y1斑马鱼SIV出芽,作用效果呈剂量依赖性,芍药苷浓度越高,SIV出芽越多。芍药苷可使Tg(fli-1:nEGFP)y7斑马鱼SIV内皮细胞个数增加,作用效果亦呈剂量依赖性,芍药苷浓度越高,SIV内皮细胞个数越多。3)芍药苷对斑马鱼头部血管的影响。VRI处理使斑马鱼初级头窦(PHS)、原始后脑通道(PHBC)、大脑中静脉(MCeV)血管缺陷伴有血流下降,而芍药苷处理一定程度上挽救了斑马鱼头部血管生长及血液供应。此外,芍药苷对斑马鱼血管新生相关基因表达的干预结果显示：4)芍药苷对斑马鱼VEGF、FGF、EGF基因表达的影响。芍药苷(12.5μM-100μM)可显著提高斑马鱼VEGFaE4E5、bFGF基因表达,而对VEGFc、FGF1、EGF基因表达无显著影响。5)芍药苷对斑马鱼flt-1、kdr、kdrl、vWF基因表达的影响。VRI处理使斑马鱼flt-1、kdr、kdrl、vWF基因表达水平下降,而芍药苷可以使flt-1、kdr、kdrl、vWF基因表达水平显著升高。2.芍药苷对HUVECs的促血管新生作用。1)芍药苷对HUVECs增殖的影响。MTT试验：可见芍药苷(0.001μM-0.03μM)显著增加了HUVECs增殖(活性)。Hoechst染色：可见芍药苷(0.01、0.03μM)可促进HUVECs增殖。2)芍药苷可促进HUVECs迁移。划痕试验：可见,芍药苷(1.0、10μM)可显著增强HUVECs迁移能力。xCELLigence RTCA DP实时监测HUVECs迁移：可见芍药苷(0.1、1.0、10 μM)均促进了HUVECs迁移,芍药苷的最大促进作用出现在6.5 h左右(选用4h-7h的数据)。3)芍药苷促进HUVECs成管。可见芍药苷(0.3μM)显著促进了HUVECs管状结构的生成。3.腺苷A1受体在芍药苷促血管新生中的作用。1)腺苷A1受体在芍药苷促斑马鱼肠下静脉血管新生中的作用。芍药苷(50μM)促进了斑马鱼SIV血管新生,DPCPX (3μM)与芍药苷(50 μM)共处理显著抑制了芍药苷的促血管新生作用,而单独应用DPCPX (3μM并未显著抑制SIV出芽。2)腺苷A1受体在芍药苷诱导斑马鱼血管生长缺陷模型血管新生中的作用。VRI(300ng/ml)处理造成了斑马鱼ISVs缺陷,而芍药苷处理挽救了VRI所致的血管缺陷,DPCPX(3μM)与芍药苷(50μM)共处理显著抑制了芍药苷的促血管新生作用,而单独应用DPCPX(3μM)并未显著加重VRI处理引起的斑马鱼ISVs生长缺陷。3)芍药苷对胞外-5’核苷酸酶的作用。不同浓度芍药苷(0.001μM-10μM)处理HUVECs 24 h,并未引起胞外-5’核苷酸酶活性改变。4)芍药苷对腺昔摄取的干预作用。不同浓度芍药苷(0.001μM-10μM)干预未对HUVECs摄取腺苷的能力造成显著影响。结论：由上述试验的结果可见,芍药苷可促进斑马鱼及HUVECs血管新生,腺苷A1受体激活可能包含在其作用机制中。