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弹性蛋白作为皮肤组成中重要的结构蛋白,在皮肤老化过程中由于弹性蛋白酶等基质金属蛋白酶含量的升高而被降解,导致皮肤失去弹性,因此,开发一种弹性蛋白酶抑制肽是抵御或延缓皮肤老化的有效方法,在抗皮肤老化功能性食品中具有非常广阔的应用前景。本文以牛动脉为主要原料,通过分析Alcalase?2.4L对牛弹性蛋白的酶解规律,优选弹性蛋白酶抑制活性较高的水解产物进行光损伤动物实验和成纤维细胞实验以验证其功效,并进一步从水解产物中分离、鉴定了4条具有高弹性蛋白酶抑制活性的肽段。在此基础上,探究了弹性蛋白酶抑制肽对光损伤成纤维细胞的保护作用机理,并对这些肽的消化吸收特性进行了研究。本文主要实验结果如下:（1）深入研究了Alcalase?2.4L对牛弹性蛋白的酶解规律,发现由于弹性蛋白结构稳定难以被深度酶解,其水解度和游离氨基酸含量都很低（最大值分别仅为2.16%和33.23μg/mL）。此外,由于弹性蛋白特殊的氨基酸组成,其水解产物含有较高水平的Gly、Ala、Val、Pro、Leu,这些氨基酸在弹性蛋白水解产物中对于抑制弹性蛋白酶具有重要作用。通过利用二维液相色谱进一步分析弹性蛋白水解产物的指纹图谱发现大分子量/极性较小的肽随酶解时间的增加被深度水解成分子量较小和/或较强极性的肽,且酶解10 h后样品指纹图谱趋于一致,结合质谱分析、鉴定了405个多肽,发现大多数肽段来自弹性蛋白中含有丰富的疏水重复单元的疏水结构域,而弹性蛋白的C末端区域中很少有蛋白片段被释放。（2）摄入弹性蛋白水解产物（Elastin hydrolysates,EH）的小鼠其皮肤含水量及羟脯氨酸含量明显增加,表皮增生和皮脂腺增生症状明显改善,表明EH可以有效保护皮肤免受紫外损伤。成纤维细胞实验结果进一步表明,EH可有助于提升光损伤的成纤维细胞细胞存活率,同时,EH能显著（p<0.05）提升光损伤的成纤维细胞中的I型胶原蛋白和弹性蛋白含量,且能够有效抑制光损伤成纤维细胞中弹性蛋白酶和胶原蛋白酶含量的升高,说明EH能通过降低弹性蛋白酶和胶原蛋白酶含量来减少UV诱导的胶原蛋白和弹性蛋白的流失。（3）以弹性蛋白酶抑制活性为指标,采取超滤、大孔树脂、C18层析、HPLC等分离技术手段从EH中分离得到具有高抑制活性的组分,并利用UPLC-Q-TOF-MS/MS对其主要肽段进行鉴定,得到了其序列分别为PY,GLPY,GLGPGV和GPGGVGAL四种多肽。通过对以上肽段分子化学合成,进一步发现四条肽段中GLPY的弹性蛋白酶抑制活性最强,在10 mM浓度下抑制率为58.77%,其次为GPGGVGAL和GLGPGVG,PY的弹性蛋白酶抑制活性最弱。除GLGPGVG对弹性蛋白酶的抑制类型属于竞争性抑制外,其他三个多肽均为混合抑制类型。GLPY对弹性蛋白酶具有最强的亲和力（6.4 kcal/mol）,其与弹性蛋白酶之间可形成5个键长较短的氢键,这可能是其具有最佳弹性蛋白酶抑制活性的主要原因。此外,在GLGPGVG、GPGGVGAL及PY和弹性蛋白酶的之间可分别观察到5个、3个及1个氢键,说明这四种多肽可以通过与弹性蛋白酶发生分子相互作用以抑制其活性。（4）GLPY等多肽可通过提升光损伤细胞内SOD的活性,抑制紫外诱导的ROS的增加,减少细胞的氧化应激反应,从而在两个方面起到减少光损伤所致成纤维细胞凋亡的作用:一方面通过抑制胞内Ca2+离子水平的增加,从而减少Ca2+离子调节的线粒体途径、内质网途径和/或死亡受体蛋白等途径引起的成纤维细胞凋亡;另一方面,下调弹性蛋白酶和胶原蛋白酶,并上调胶原蛋白mRNA表达以促进胶原蛋白合成,最终减少细胞基质的降解,从而抑制成纤维细胞的失巢凋亡;（5）PY,GLPY,GLGPGVG和GPGGVGAL四个多肽均能不同程度地被胃肠道消化酶系降解,其弹性蛋白酶抑制活性在经胃肠道消化后均呈现显著降低的趋势,其中PY和GPGGVGAL在消化后已不具备弹性蛋白酶抑制活性。GLPY,GLGPGVG消化后活性的降低与其消化产物GL,PY,LGPGVG和G的活性较低有关。在Caco-2模拟小肠吸收模型中,尽管6.50%的GLPY和56.51%的GLGPGVG被小肠细胞刷状边界膜的酶及胞内酶进一步水解,但仍有较大部分肽段被细胞所直接吸收。GLPY和GPGGVGAL的表观渗透率分别为1.02×10-66 cm/s和0.47×10-6 cm/s,其中,GLPY较GLGPGVG更易被吸收,且其主要通过转胞吞途径被吸收,需消耗能量,其转运途径部分依赖于转运蛋白PepT1。