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慢性粒细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia，CML）是一种起源于白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs)的恶性增殖性疾病，迄今没有有效的根治办法。目前国内外的研究普遍认为LSC是正常造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSCs）经BCR-ABL癌基因转化而来。由于BCR-ABL基因编码的BCR-ABL融合蛋白具有持续活化的酪氨酸激酶活性，使得LSC具有比HSC更强的自我更新和增殖能力而大量扩增。LSCs也因此被认为是CML发病的根源，靶向BCR-ABL清除LSCs对于治愈CML具有重要的临床意义。格列卫（Imatinib Mesylate，IM）是以BCR-ABL蛋白为靶点治疗CML的分子靶向药物，能使绝大部分CML患者获得有效缓解，成为当前CML治疗的一线药物。然而，研究发现IM只能杀死增殖的成熟CML细胞而不能有效诱导LSCs凋亡。因此，IM不能彻底清除CML患者体内的LSCs而无法根治CML。LSCs对格列卫的凋亡抗性机制迄今不完全清楚。阐明LSCs的格列卫凋亡抗性机制对于以LSCs为靶点制定根治CML的策略具有重要意义。大量的研究表明，miR-21的异常表达与肿瘤细胞耐药密切相关miR-21抑制剂能有效增强化疗药物对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。目前，miR-21在LSCs中的表达及其与LSCs的格列卫凋亡抗性的关系尚无研究报道，有待深入探讨。本论文采用Real-time PCR技术检测IM处理后CML CD34+干/祖细胞以及Sup-b15细胞和CML细胞K562、Ku812的miR-21的表达水平变化，在此基础上，进一步通过miR-21激动剂及其抑制剂转染、流式细胞术等方法，研究miR-21在调控CMLCD34+干/祖细胞对IM的凋亡抗性中的作用及其分子机制。研究目的本论文通过研究miR-21在调控CD34+干/祖细胞对IM的凋亡抗性中的作用及其分子调控机制，探索增强IM清除LSCs的策略，为以LSCs为靶点根治CML提供参考资料和科学依据。研究方法1.探讨miR-21在调控CML CD34+干/祖细胞对IM凋亡抗性中的作用1.1使用Ficoll利用密度梯度离心法把健康人和CML病人的骨髓样本进行分离，分别获得健康人和CML病人的骨髓单个核细胞（BMMC）；利用免疫磁珠分选系统（MACS）对健康人和CML病人的骨髓单个核细胞分别进行分选，获得健康人和CML病人CD34+干/祖细胞；流式细胞术鉴定CD34+干/祖细胞的分子表型及其纯度。1.2Annexin V/PI双染法检测IM诱导的CML CD34+干/祖细胞凋亡；Real-time PCR检测IM处理后CML CD34+细胞的miR-21表达水平；Annexin V/PI双染法检测转染antagomiR-21对IM诱导的CML CD34+细胞凋亡的影响。1.3MTS方法检测IM对Sup-b15细胞增殖的影响；Annexin V/PI双染法检测IM诱导的Sup-b15细胞凋亡；Real-time PCR检测IM处理后Sup-b15细胞的miR-21表达水平；Annexin V/PI双染法检测Sup-b15细胞转染antagomiR-21后，IM诱导的细胞凋亡变化。1.4MTS方法检测IM对CML细胞K562和Ku812的细胞增殖影响；Annexin V/PI双染法检测IM诱导的CML细胞K562和Ku812的细胞凋亡；Real-time PCR检测IM处理后CML细胞K562和Ku812的miR-21表达水平；Annexin V/PI双染法检测K562和Ku812转染agomiR-21后，IM诱导的细胞凋亡变化。2.探讨miR-21调控CML CD34+细胞对IM凋亡抗性的分子机制研究2.1流式细胞术检测CML CD34+细胞和三种Ph+白血病细胞（K562、Ku812、Sup-b15）细胞经过IM处理后细胞内PTEN和PDCD4蛋白的表达水平变化；检测CD34+干/祖细胞转染antagomiR-21后PDCD4及磷酸化AKT蛋白的变化情况，评价抑制miR-21对PI3K/AKT信号通路的影响。2.2Annexin V/PI双染法检测PI3K抑制剂（Wortmannin或LY294002）和IM联合作用于CML CD34+细胞和Sup-b15细胞后，CML CD34+细胞和Sup-b15细胞的细胞凋亡。2.3流式细胞术检测PI3K抑制剂（Wortmannin或LY294002）和IM联合作用于CMLCD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞后细胞内磷酸化AKT蛋白的变化情况。实验结果1.探讨miR-21在调控CML CD34+干/祖细胞对IM凋亡抗性中的作用1.1流式细胞术检测结果显示，免疫磁珠分选系统纯化的CD34+干/祖细胞的纯度为89.23%。1.2细胞凋亡结果显示CML CD34+干/祖细胞对IM不敏感；经过IM处理后miR-21表达水平有一定的上调；转染antagomiR-21能显著增加IM诱导的CML CD34+干/祖细胞凋亡，细胞凋亡率由对照组的3.983±0.2973增加至9.437±0.5601。1.3Sup-15细胞对IM诱导的细胞凋亡不敏感；在IM处理后miR-21表达也发生一定的上调；转染antagomiR-21明显地增强IM诱导Sup-b15细胞凋亡。1.4IM对K562和Ku812细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用随着IM浓度的升高以及处理时间的延长显著升高；在IM处理后K562和Ku812细胞的miR-21表达均下调；转染agomiR-21能抑制IM诱导K562和Ku812细胞凋亡。2.探讨miR-21调控CML CD34+干/祖细胞对IM凋亡抗性的分子机制研究2.1IM处理后CML CD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞的PDCD4表达水平下调，K562和Ku812的PDCD4表达水平上调；而CML CD34+干/祖细胞和三种Ph+白血病细胞（K562、Ku812、Sup-b15）的PTEN表达水平均下调；转染antagomiR-21后CML CD34+干/祖细胞PDCD4、PTEN和p-AKT的表达水平均下调。2.2使用PI3K抑制（Wortmannin和LY294002）阻断PI3K/AKT信号通路后，IM诱导的CML CD34+干/祖细胞和Sup-b15的细胞凋亡显著增加。2.3使用PI3K抑制剂（Wortmannin和LY294002）阻断PI3K/AKT信号通路后，IM诱导的CML CD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞的p-AKT蛋白表达均显著下调。结论miR-21通过PI3K/AKT信号通路介导CD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞对IM的凋亡抗性。