【摘 要】
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为提高相思豆毒素A链(ABRaA)的表达量,根据E. coli对密码子的偏好性,设计并合成相互重叠的24条长片段寡核苷酸引物,以两步PCR法合成了优化的ABRaA片段,并克隆到pGEM-T载体中,
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为提高相思豆毒素A链(ABRaA)的表达量,根据E. coli对密码子的偏好性,设计并合成相互重叠的24条长片段寡核苷酸引物,以两步PCR法合成了优化的ABRaA片段,并克隆到pGEM-T载体中,测序结果正确后,亚克隆至pMBP-p、pET-Dsba、pET-Trx和pET-His系列载体,分别构建了分泌型、融合型、非融合型三种类型的原核表达载体.转化E.coli受体细胞中,经IPTG诱导,均有目的蛋白表达,其中有两种是可溶性表达,但尤以非融合型pET-HisA载体表达最成功,可溶性目的蛋白占菌体总蛋白30﹪左右.借助表达蛋白带有6×His标签的特性,采用固相化Ni-NTA亲和层析柱对重组相思豆毒素A链(rABRaA)蛋白进行一步纯化,洗脱峰中目的蛋白的纯度高达98﹪左右.Western印迹分析证明,rABRaA可以与兔抗天然abrin抗体发生特异性的结合反应.纯化的rABRaA蛋白作用于大鼠肝rRNA,经苯胺处理后,能使rRNA释放出一段420bp左右的特征性寡核苷酸片段,表明其具有RNA N-糖苷酶活性.通过[<3>H]-亮氨酸掺入证明,rABRaA蛋白可有效抑制兔网织红细胞裂解液中蛋白质的合成,其IC<,50>为8.5×10<-11>M.此外,MTT法证明,rABRaA蛋白对人肝癌细胞SMMC-7721和Sp2/0也有杀伤作用,其IC<,50>约为5.2×10<-6>M和5.8×10<-7>M.该研究为发展肿瘤导向治疗的"弹头分子"及abrin诊断试剂奠定了基础.
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