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本文以我校培育出的超级稻沈农606和沈农265为试材,从成熟胚愈伤组织的诱导,愈伤组织的继代,细胞悬浮培养和原生质体的分离,植株再生等方面进行了研究,优化了沈农606和沈农265的组织培养条件,建立了高效的植株再生体系。并且以沈农265的愈伤组织为受体,进行了农杆菌介导外源基因转化的研究。主要结果如下:
1.沈农606和沈农265的成熟胚在以MS为基本培养,添加3mg/L2,4-D,30g/L蔗糖,0.8%琼脂,pH为5.8的诱导培养上,27℃条件下培养30天,能够诱导出质量较好的愈伤组织,诱导率均可以达到90%以上。研究还表明生长素2,4-D对愈伤组织的诱导起着主要作用;适量的6-BA和ABA对愈伤组织的诱导起到一定的积极作用,但效果不明显;蔗糖浓度高于40g/L时,诱导率急剧下降;愈伤组织的诱导受温度的影响很大;而有无光照对愈伤组织的诱导没有影响。
2.优化出沈农606和沈农265的愈伤组织继代培养基为:以N6为基本培养,添加2.5mg/L的2,4-D和500mg/L的脯氨酸,蔗糖浓度为30g/L,琼脂8g/L,pH为5.8。在这样的培养上两个品种的愈伤组织可以快速的生长增殖。沈农606的继代时间为不超过27天,沈农265的继代时间为30天以内。在继代过程中在基本培养基对愈伤组织生长影响显著,其中N6最有利于愈伤组织生长;培养基中添加细胞分裂素对愈伤组织的生长没有促进作用;在继代培养基中添加脯氨酸可以显著促进愈伤组织的生长,而水解酪蛋白和谷氨酰胺作用不显著;蔗糖浓度对愈伤组织生长影响显著,30g/L的蔗糖最有利于愈伤组织生长;光照对愈伤组织的增殖没有影响,但是却可以影响愈伤组织的生长状态,容易使其失去胚性而变白。
3.以N6为基本培养基,添加2mg/L的2,4-D,1000mg/L的脯氨酸,30g/L的蔗糖,pH为5.8的液体培养基有利于沈农265细胞悬浮培养的生长增殖。细胞团在悬浮培养过程中,生长素和细胞分裂素对其增殖影响不显著;而脯氨酸可以显著促进细胞团的生长。以悬浮培养的细胞团为外植体,利用上海生产的纤维素酶和其他试剂组成的酶液可以成功地分离到原生质体。
4.将沈农606和沈农265悬浮培养的细胞团,接种于以N6为基本培养基,添加6-BA4mg/L、NAA 0.5mg/L、30g/L蔗糖、0.8%琼脂的分化培养基上,可以较好的获得再生植株。细胞团经过悬浮培养可以更好的保持胚性,分化能力较强,而愈伤组织长期继代后失去分化能力。通过对悬浮培养的细胞团长期继代培养,可以促进细胞团中体细胞胚的形成,通过体细胞胚发生途径更容易获得再生植株。
5.携带双元载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织,获得了能够在含有潮霉素的培养基上生长的愈伤组织,并用PCR对生长的愈伤组织进行HptII基因检测,结果为阳性。初步认为带有HptII基因的T-DNA成功的插入到水稻基因组中。