【研究背景与目的】下腰痛(Low Back Pain)及颈肩痛(Neck pain)作为现代社会最为常见的疾患之一,严重影响着人们的生活质量。流行病学调查显示大约超过80%的人,一生中有过一次或多次下腰痛或肩颈痛的经历,其中超过15%的人其严重程度需要住院治疗才能达到缓解。作为医院门诊患者就诊的常见病因之一,每年因上述症状造成的直接或间接社会经济损失巨大。目前对于引起下腰痛及颈肩痛主要的病因学研究显示,超过40%的下腰痛及20%的颈肩痛患者主要是由于他们的椎间盘退变(Intervertebral Disc Degeneration,简称IDD)及IDD所继发的一系列病变导致的。对于IDD患者而言,目前有效的治疗方法离不开外科手术对退变椎间盘的切除治疗。然而在切除退变椎间盘的同时需要植入融合器并予螺钉固定,在牺牲患者脊柱活动度的同时给患者经济上带来严重的负担。因此,寻找新的椎间盘退变治疗或椎间盘再生的方法一直是该领域的研究热点之一。随着干细胞研究领域的发展,以干细胞为主的再生医学以及生物治疗方法引起学者广泛关注。通过使用干细胞移植、组织工程移植和改变局部微环境诱导干细胞再生等创新的医疗手段的帮助下,能够达到修复受损的组织、重建病变等目的。目前研究较多的具有组织再生及修复能力的细胞中,由于间充质干细胞(MSC)的获取相对容易、分化能力强以及研究较为深入等原因使其成为应用最为广泛而可靠的种子细胞,是目前再生医学的研究热点之一。以MSC为主的再生医学治疗方式有望为椎间盘退变患者带来手术以外的另一种治疗选择。但几乎所有MSC等干细胞都存在有创采集、分离数量少、年龄依赖性强及体外扩增能力有限等缺点极大限制其临床应用。作为能够起到治疗作用的多能干细胞,其在人体内正常新陈代谢的过程中其数量会不断减少、修复能力不断减弱。其次,由于其数量稀少,在采集与体外扩增时常会混入非干细胞的成体细胞,最终在体外扩增及治疗中影响干细胞的纯度以及疗效。再者,以MSC为主的成体多能干细胞,其在体外扩增的过程中亦会不断发生细胞衰老(Senescence),并在此过程中丧失其多向分化潜能。而在椎间盘退变方面,由于髓核的结构特殊使得其内环境处于低氧且营养物质匮乏的状态,传统的MSC移植后成活效率较低。此外,由于髓核体积小、周围有坚固的纤维环包裹、含水量多等特点,使其仅可容纳少量的MSC进入髓核,极大限制了其治疗的效果。综上所述,对于椎间盘退变的再生医学治疗而言,迫切需要寻找一种易获取、形状稳定、免疫原性低、修复效果好的干细胞替代物来弥补上述的不足。为了寻找合适的干细胞替代物,学者们从干细胞修复受损组织或促进组织再生的机理方面进行了深入的研究,并发现MSC不仅通过自身增殖分化替代受损组织,更可以通过旁分泌重要的微环境调控物质——外泌体(Exosomes)来改变受损组织周围微环境,从而调控细胞增殖、分化、凋亡等生物学功能,间接实现修复治疗作用。外泌体(Exosomes)是细胞通过出芽方式分泌的纳米级(40-120nm)双层膜结构的囊性小泡。由于其具有如同细胞膜般的双层磷脂膜结构,因此具有良好的渗透性与稳定性,能够与靶细胞进行融合;其内富含细胞来源的m RNA、mi RNA以及蛋白质成分,且上述成分能够在参入靶细胞后对靶细胞的功能及信号起到重要的调控作用;由于近乎所有细胞均会分析外泌体,而不同细胞来源外泌体内成分差异较大,因此其被认为是重要的局部微环境调控介质,同时也是干细胞对诸多脏器修复起作用的重要成分。目前已有许多文献报道MSC来源外泌体具有与MSC相似的功能,如其能够对损伤的组织进行修复、抑制炎症反应、调节免疫反应等。与单纯MSC应用相比,MSC外泌体具有诸多的应用优势,如性质稳定、易于保存、没有免疫原性、获取容易且方便改造等诸多优势,为多种疾病的治疗提供了新的手段。而具有上述特点的MSC来源外泌体可能成为弥补传统MSC治疗方法在椎间盘退变修复中的不足的理想替代物。课题组在前期研究中已经发现MSC来源外泌体能够显著促进髓核细胞ECM的合成。作为髓核ECM重要合成酶,CHSY同时参与多种疾病的发生发展过程中。CHSY的功能异常会导致硫酸软骨素(CS)的合成减少,其与IDD的发生亦密切相关。基于上述内容,我们推测MSC来源的外泌体可能通过激活髓核细胞ECM合成相关酶CHSY的表达来促进椎间盘的修复。第一部分:间充质干细胞外泌体的分离与鉴定方法:(1)将将冲洗下来的液体制成单细胞悬液,经过商品化Percoll密度梯度离心剂离心分离和收集有核细胞,再利用含15%胎牛血清的DMEN培养基重悬管中细胞进行骨髓间充质干细胞进行原代培养。(2)利用流式细胞仪器检测CD105,CD34,CD44,CD14,CD90,CD45,CD19等间充质干细胞表面标志物的表达;利用商品化成骨、成脂分化诱导培养基对细胞进行诱导鉴定。(3)将二代后的MSC细胞于T75以上培养瓶中进行扩增。待细胞达到90%融合度时更换低血清培养基,通过每两天一次收集培养基的方式进行连续收集,利用超速离心机对收集的上清液进行外泌体体离心纯化。(4)通过SDS-PAGE电泳及Western-Blot检测外泌体中特定的蛋白表达情况。通过透射电镜或Nanosight可以分析外泌体的大小、形态。(5)利用PKH67实验明确外泌体的融合能力。结果:(1)通过8例骨髓收集,成功进行骨髓来源MSC原代培养7例,均状态良好。(2)流式细胞学检测MSC标志物CD105,CD34,CD44,CD14,CD90,CD45,CD19示原代培养MSC符合国际界定MSC指标。成骨及成脂诱导后,原代培养MSC显示出明显的钙结节及脂肪滴。(3)通过大量培养MSC并收集上清进行超速离心,获得明显的沉淀并进行再次离心纯化。(4)通过Western Blot检测发现收集得到的沉淀物表达外泌体特异性CD81及CD63,Nanosight及电镜检测均显示收集得到的沉淀为外泌体。(5)利用PKH67染料染色外泌体并加入至MSC中,结果显示MSC能够被外泌体染色,提示收集得到的外泌体具有膜融合能力。结论:我们通过骨髓MSC细胞的原代培养获得了符合国际标准的骨髓MSC细胞。对原代MSC细胞进行扩增及上清的收集后,利用超速离心的方法能够得到较为纯的外泌体。同时利用外泌体标记物及功能实验明确收集得到的确为外泌体。第二部分:间充质干细胞来源外泌体对退变椎间盘的影响方法:(1)收集30-50年龄段的正常髓核组织进行原代培养。(2)利用超速离心后的上清液作为去外泌体上清作组,即对照组;利用未培养过细胞的原始培养基通过超速离心作为空白对照组;利用HEK293细胞的培养上清进行外泌体的分离,得到的外泌体作为阴性对照组;而MSC来源外泌体作为实验组处理原代髓核细胞。(3)通过加入蛋白定量后不同浓度的上述样品至髓核细胞,培养24h后通过PCR、Western Blot以检测处理后髓核细胞细胞外基质分泌表达情况。(4)通过加入定量后不同浓度的上述分组样品至髓核细胞,培养24h后通过PCR、Western Blot检测处理后髓核细胞ECM降解相关MMP、ADAMTS的表达情况。(5)同上处理后通过PCR、Western Blot检测处理后髓核细胞ECM合成相关CHSY等酶的表达情况。结果:(1)通过原代培养髓核组织,成功建立体外髓核细胞系6株。(2)成功收集MSC培养上清分离得到的外泌体、去外泌体上清、原始培养基以及HEK293来源外泌体。(3)分组处理后实验组髓核细胞其2型胶原、蛋白聚糖表达量均高于对照组及阴性对照组。(4)分组处理后实验组髓核细胞MMP1、MMP2、MMP7表达较对照组及阴性对照组出现显著下调。(5)分组处理后实验组髓核细胞CHSY1、CHSY2、CHSY3表达较对照组及阴性对照组出现显著上调。结论:通过原代培养髓核组织获得正常人髓核细胞株5株。通过BCA法对分组样品进行定量,定量后处理细胞发现MSC来源外泌体具有上调髓核细胞ECM合成酶以及ECM合成的作用,并降低ECM降解酶的表达。第三部分:MSC外泌体通过上调CHSY保护椎间盘髓核细胞方法:(1)利用高通量RNA测序技术检测外泌体处理后髓核细胞的转录组表达变化。(2)生物信息学分析MSC来源外泌体促进髓核细胞ECM合成酶的机制。(3)利用高通量测序技术检测外泌体中的micro RNA分子,并筛选与CHSY结合的椎间盘退变相关mi RNA并通过双荧光素酶报告基因实验验证。(4)过表达预测的候选mi RNA,研究其对CHSY以及髓核细胞ECM分泌的变化。(5)双荧光素酶实验明确外泌体内micro RNA对CHSY的靶向机制。结果:(1)利用高通量转录组测序技术发现MSC外泌体处理后髓核细胞转录组水平基因表达与对照组相比存在显著差异。(2)利用GO分析发现MSC外泌体能够显著影响髓核细胞转录后调控因子的改变,提示外泌体促进CHSY的表达可能与转录后调控有关。(3)利用高通量mi RNA测序技术发现MSC来源外泌体较对照及HEK293外泌体具有较高的micro RNA表达。(4)靶基因预测分析发现MSC外泌体内含有能够显著抑制CHSY负向调控因子,IL-1以及TNF-α通路下游因子NF-κB的mi RNA。(5)靶向实验验证了MSC外泌体中的候选mi RNA能够直接抑制NF-κB的表达,从而促进CHSY降低MMP的表达。结论:利用高通量检测联合生物信息学分析,我们发现了MSC来源外泌体能够显著提高髓核细胞转路后调控因子的表达,意味着mi RNA等转录后调控因子与外泌体促进IDD中ECM合成密切相关。利用高通量mi RNA组分析MSC来源外泌体并结合生物信息学预测技术,我们发现了一批CHSY抑制性NF-κB的靶向性mi RNA,并利用相应实验对其进行了验证。小结本研究通过探究MSC来源外泌体对髓核细胞的作用,利用高通量转录组及mi RNA组学分析手段,首次发现了髓核细胞退变引起的ECM合成酶的降低主要是通过IL/TNF等促炎因子诱导的CHSY靶向性mi RNA引起的。我们发现了mi R-194、mi R-515在IDD中发现显著上调,而通过功能学验证明确了上述mi RNA确实能够引起CHSY表达的变化,而且上述mi RNA还直接受到IL/TNF的调控。通过上述研究启发了关于CHSY的调控机制。在MSC外泌体提高CHSY表达的发现基础上,我们进一步针对外泌体中富含的mi RNA成分进行深入研究分析,发现在MSC外泌体中高表达的mi RNA中mi R-199、-16、-195能够结合NFκB,而NFκB作为IL/TNF的重要上游调控元件,对椎间盘退变以及ECM合成的减少具有至关重要的作用。后续研究进一步证实了外泌体能够通过传递mi R-199、-16、-195影响髓核细胞IL/TNF的生成,从而减少CHSY表达的降低促进椎间盘退变的恢复。