【摘 要】
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螺原体是一类形态为螺旋形、有运动性、无细胞壁的微生物,它的宿主分布广泛,其中中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)是从患有“颤抖病”的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)中发现的,是首次从水生甲壳动物体中发现的一种新型螺原体病原。前期研究表明,螺原体通过虾蟹类的鳃或者体表进入体内,在血淋巴细胞(靶细胞)中大量扩增繁殖,并随血液流通到各器官的结缔组织中,进而
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螺原体是一类形态为螺旋形、有运动性、无细胞壁的微生物,它的宿主分布广泛,其中中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)是从患有“颤抖病”的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)中发现的,是首次从水生甲壳动物体中发现的一种新型螺原体病原。前期研究表明,螺原体通过虾蟹类的鳃或者体表进入体内,在血淋巴细胞(靶细胞)中大量扩增繁殖,并随血液流通到各器官的结缔组织中,进而引起机体的无力与不食和感染后期的附肢颤抖症状。中华绒螯蟹螺原体不仅可以侵染水生甲壳动物,而且还可以侵染鸡胚和乳鼠,导致乳鼠产生白内障症状。为了有效控制中华绒螯蟹螺原体引起的疫病,不仅要对致病菌的生物特性和体内感染情况进行研究,还应该在细胞水平上对致病菌感染靶细胞的行为和机制展开研究。虽然螺原体感染宿主靶细胞模型的建立是研究螺原体分子水平感染机制的理想策略,但由于缺乏完整的甲壳动物细胞系,而果蝇S2细胞作为节肢动物的模式细胞,可以用来研究螺原体的分子侵染机制。因此,本论文建立了螺原体感染果蝇S2细胞的模型,然后应用该模型对中华绒螯蟹丝氨酸蛋白酶抑制剂和组织蛋白酶D的功能展开研究。1.中华绒螯蟹螺原体感染S2细胞模型的建立基于中华绒螯蟹螺原体(S.eriocheiris)菌株TDA-040725-5T体外感染果蝇S2细胞建立细胞感染模型。螺原体感染后,用倒置荧光显微镜观察S2细胞形态,发现随着侵染时间的延长,细胞的增殖能力逐渐减弱。流式细胞仪结果显示感染48 h后S2细胞的坏死和凋亡明显增多。活性氧检测发现侵染S2细胞9 h后,荧光值达到最高,说明S2细胞对螺原体产生免疫应答。免疫荧光技术确定了螺原体在S2细胞中的分布,发现螺原体主要以单个个体感染并进入细胞。使用透射电子显微镜(TEM)发现螺原体进入细胞后会大量繁殖扩增形成包涵体,而且螺原体的侵染会使S2细胞产生空泡化等特征。当用网格蛋白介导的内吞途径抑制剂(氯丙嗪和Dynasore)预处理细胞时,S2细胞中的螺原体感染被强烈抑制,同时细胞活性显著升高;巨胞饮途径的抑制剂(蛋白激酶C抑制剂和肌球蛋白轻链激酶抑制剂)预处理S2细胞时显著降低了螺原体的侵染量,同时细胞活性显著升高;相反,小凹蛋白介导的内吞途径抑制剂(甲基-β-环糊精和制霉菌素)破坏了细胞胆固醇后对螺原体感染并没有影响。以上表明中华绒螯蟹螺原体通过网格蛋白介导的内吞途径和巨胞饮途径进入S2细胞,但并不依赖小凹蛋白介导的内吞途径。此外用细胞骨架抑制剂(细胞松弛素B和诺考达唑)明显降低了螺原体对S2细胞的感染量,同时细胞活性显著升高,说明螺原体感染依赖微丝或微管。本研究首次成功地证明了S.eriocheiris可以侵染果蝇S2细胞并确定了其侵染方式,为以后在分子水平上研究中华绒螯蟹螺原体感染无脊椎动物细胞的机理奠定了基础。2.Esserpin-2在S2细胞中的功能研究利用建立的中华绒螯蟹螺原体感染S2细胞模型,研究中华绒螯蟹丝氨酸蛋白酶抑制剂-2(Esserpin-2)的功能。亚细胞定位实验表明重组Esserpin-2主要位于细胞质中,Esserpin-2可以增加中华绒螯蟹螺原体在S2细胞中的拷贝数并导致细胞死亡。3.EscatD在S2细胞中的功能研究利用S2细胞模型研究中华绒螯蟹组织蛋白酶D(EscatD)的功能。亚细胞定位实验表明EscatD主要存在于细胞质中,EscatD可以降低S.eriocheiris的拷贝数并增加细胞活力。这些结果都表明利用S2细胞模型可以更好地阐明Esserpin-2和EscatD的功能,从而更好地理解调节S.eriocheiris和宿主之间相互作用的潜在机制。
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