论文部分内容阅读
目的:探究β-环连蛋白抑制基因2（Dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 2,DACT2）在胶质瘤组织和非肿瘤脑组织中的表达情况,与患者预后的相关性。观察其对胶质瘤增殖和凋亡的影响及其相关分子作用机制。方法:1.从美国癌症和肿瘤基因图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库获取DACT2在不同级别胶质瘤中的表达水平,分析DACT2表达情况与临床病理特征的关系,并对预后分析;收集重庆医科大学病理科2008-2012年80例胶质瘤组织和10例非肿瘤脑组织石蜡包埋标本,免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）检测DACT2表达情况;2.收集2015-2016年重庆医科大学附属第二医院神经外科胶质瘤手术标本8例和对应的瘤旁组织,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot,WB）分析DACT2在肿瘤组织和癌旁组织之间的表达差异;3.Real-time PCR和WB检测DACT2在不同胶质瘤细胞株（U251,U87,SHG44,A172）中表达差异,慢病毒转染不同胶质瘤细胞株,建立DACT2稳定转染过表达U251,U87细胞株（Over-DACT2）,稳定转染低表达SHG44,A172细胞株（Sh-DACT2）,Real-time PCR和WB检测转染效率;4.细胞计数试剂盒（Cell counting kit-8,CCK8）,5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）检测各组胶质瘤细胞增殖能力,流式细胞技术（Flow cytometry,FCM）检测细胞周期改变,FCM和原位末端凋亡法（TdT-mediated d UTP-biotin nick end labeling,TUNEL）检测各组胶质瘤细胞凋亡能力;5.WB检测DACT2对YAP活化及其下游靶基因（PCNA,Clyclin D1,Bax）表达的影响,免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测DACT2对YAP入核的调控作用;6.慢病毒共转染DACT2和YAP,建立DACT2,YAP稳定转染过表达U251,U87细胞株（Over-DACT2/Over-YAP）,WB检测转染效率及PCNA,ClyclinD1,Bax表达情况,CCK8,BrdU检测各组胶质瘤细胞增殖能力,FCM检测细胞周期改变,FCM和TUNEL检测各组胶质瘤细胞凋亡能力;7.裸鼠皮下成瘤,分析DACT2对肿瘤体积和重量的影响,IHC检测肿瘤中YAP,PCNA,CyclinD1,Bax的表达情况。结果:1.DACT2在胶质瘤中表达较非肿瘤脑组织表达明星降低,且与胶质瘤WHO分级呈负相关,单因素和多因素分析显示DACT2能够作为预测胶质瘤患者预后的分子标志物;2.胶质瘤组织中DACT2表达较瘤旁组织中显著降低;3.Over-DACT2-U251,U87细胞株中DACT2 m RNA和蛋白表达水平较对照组（Control,Ctrl）明显增加,而Sh-DACT2-SHG44,A172细胞株中DACT2 mRNA和蛋白表达水平较对照组（Sh-Control,ShCtrl）显著降低,证明DACT2稳定转染过表达U251,U87细胞株和稳定转染低表达SHG44,A172细胞株模型建立成功;4.过表达DACT2能显著抑制U251,U87细胞株增殖和周期进程,促进凋亡,敲低DACT2能明显促进SHG44,A172细胞株增殖及周期进程,抑制凋亡;5.DACT2能够降低YAP,PCNA,CyclinD1表达,增加Bax,p-YAP（Ser127）表达,抑制YAP入核;6.过表达YAP可以翻转DACT2过表达导致的生长抑制和凋亡促进作用;7.DACT2可以抑制皮下肿瘤的形成,免疫组化提示DACT2抑制YAP,PCNA,CyclinD1,促进Bax在皮下肿瘤内的表达。结论:1.DACT2在胶质瘤组织中低表达,其表达水平高低与胶质瘤WHO分级和预后相关;2.DACT2抑制胶质瘤增殖,诱导周期阻滞,促进凋亡;3.DACT2促进YAPSer127磷酸化,抑制YAP入核,增加YAP降解,进而影响胶质瘤细胞增殖和凋亡;综上所述,DACT2作为一个新的抑癌基因,参与了胶质瘤的发生发展,有望成为胶质瘤潜在的治疗靶点。