论文部分内容阅读
高迁移率簇蛋白1 (High mobility group box-1 protein, HMGB1)是一种存在于几乎所有真核生物细胞内的保守的染色体结合蛋白,在胞内,它能够与DNA直接相结合,或者与一些调节性的蛋白以及与DNA形成复合物,增强转录因子(如NF-κB)与靶基因相结合,从而激活靶基因的转录：HMGB1还可以通过主动分泌或被动释放到细胞胞外,作为一种炎症因子促进炎症的发生与发展。髓系来源的抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一群异质性的未成熟的细胞群体,在肿瘤和炎症等病理过程中起着重要的免疫负调节作用。有研究报道,在急性或慢性炎症过程中MDSCs募集均增多,并且能发挥抑制炎症的作用；采用外源性HMGB1刺激MDSCs能通过激活下游NF-κB通路来增强其免疫抑制功能,但是,MDSCs胞内自身表达HMGB1对其影响尚不清楚。故本课题拟采用DSS诱导的小鼠急性肠炎模型,通过siRNA干扰肠炎小鼠MDSCs内源性HMGB1的表达,从而研究胞内HMGB1对MDSCs免疫抑制功能的影响及其相关的分子机制,为临床上肠炎等炎症性疾病的治疗提供新的理论依据和线索。第一部分干扰HMGBl表达对MDSCs免疫抑制功能的影响及其分子机制研究方法1.构建DSS诱导的小鼠急性肠炎模型,分离纯化其脾脏中MDSCs,运用Western Blot和ELISA技术检测小鼠肠炎各时期MDSCs的百分比、是否分泌HMGB1,并利用其体外培养上清液刺激RAW 264.7细胞,采用RT-PCR技术验证其分泌的HMGB1是否具有促炎活性。2.设计并合成HMGB1的siRNA序列,通过瞬时转染干扰MDSCs内源性HMGB1的表达。3.运用CFSE增殖递减法检测MDSCs对T细胞增殖抑制功能的改变,运用ELISA、流式细胞术以及RT-PCR等技术检测MDSC功能相关分子IL-10、TGF-p. iNOS、Arg-I和ROS的表达以及NO的产生。4.运用流式细胞术检测各组MDSCs分化成熟的表面标志CD80, CD86和MHC-II类分子I-A/I-E的表达。5.运用Western Blot技术检测各组MDSCs中NF-κB (p-p65及IκB-α)的表达；采用外源性HMGB1激活MDSCs中NF-κB的活性,从而验证MDSCs功能降低是否与NF-κB的失活有关。结果1.小鼠在饮含2.5%DSS水后第8天急性肠炎症状(如粪便潜血、体重下降)明显,而在第19天肠炎症状基本消失；急性肠炎期脾脏及肠系膜淋巴结的MDSCs比例逐渐增高,且恢复期MDSCs比例显著高于急性期。2.通过Percoll密度梯度离心法及免疫磁珠法分离、纯化急性肠炎恢复期小鼠脾脏的MDSCs,其纯度可达95%以上：此MDSCs能够分泌大量HMGB1,且后者能刺激RAW264.7细胞分泌促炎因子IL-1p和IL-6等。3.转染HMGB1的siRNA序列能够在mRNA及蛋白水平上干扰MDSCs胞内HMGB1表达。4.瞬时干扰HMGB1表达后能降低MDSCs对T细胞增殖的抑制作用,主要通过降低MDSCs的iNOS和IL-10表达及NO产生,从而降低其免疫抑制功能。5.瞬时干扰HMGB1表达后MDSCs表型趋于成熟,其表达CD80和MHC-II类分子I-A/I-E的水平显著增高。6.运用Western Blot技术检测NF-κB的表达,结果发现瞬时干扰HMGB1后MDSCs中p65磷酸化水平以及IκB-a降解显著降低；给予外源性HMGB1刺激能逆转MDSCs的NF-κB活性,恢复MDSCs对T细胞增殖的抑制功能,增加其iNOS和IL-10表达及NO释放。上述结果表明：干扰MDSCs内源性HMGB1表达能显著降低MDSCs的NF-κB活性,从而降低MDSCs的免疫抑制功能,促进其分化成熟。第二部分干扰HMGB1表达能降低MDSCs对小鼠急性肠炎的抑制作用方法1.分别在给小鼠饮含2.5%DSS水的第2、4和6天,经尾静脉将干扰HMGB1表达后的MDSCs回输至肠炎小鼠；2.观察饮含2.5%DSS水后第8天急性肠炎小鼠的体征、结肠长度及结肠组织的病理改变：3.运用ELISA技术检测急性肠炎小鼠血清及结肠组织匀浆中的细胞因子IL-1β、IFN-γ、IL-10及小分子NO等的变化。结果1.相对于MDSCs输注对照组,过继输注瞬时干扰HMGB1的MDSCs组其小鼠急性结肠炎的体征以及结肠的病理损伤均明显加重；2.相对于MDSCs输注对照组,过继输注瞬时干扰HMGB1的MDSCs组的急性结肠炎小鼠血清及结肠组织匀浆中抑炎因子IL-10及NO表达水平显著下降,而促炎因子IL-1p及IFN-y表达水平显著升高。上述结果说明：相对于MDSCs输注对照组,过继输注干扰HMGB1表达的MDSCs对DSS诱导的小鼠急性肠炎的抑制作用显著下降。结论内源性HMGB1对维持MDSCs细胞的未成熟状态及免疫抑制功能必不可少,干扰内源性HMGB1的表达能够明显减弱MDSCs的NF-κB活性,促进MDSCs的分化成熟,导致MDSCs免疫抑制功能显著下降,从而削弱其在小鼠急性肠炎中的抗炎作用。