1 研究背景Castleman病(Castleman Disease,CD)又称为巨大淋巴结病或血管滤泡性淋巴结增生症,是一种较为少见的炎症性淋巴结增生性疾病,病因及发病率仍不明确。该病的诊断主要依靠活检组织的病理组织学和排外恶性肿瘤、风湿免疫系统疾病及感染性疾病而作出判断。但是目前国内国际尚无公认的统一的诊断标准,其诊疗方案仍有待进一步完善。CD的病因及发病机制目前尚不清楚,已经发现细胞因子异常增高如IL-6、IL-1、TKF-a、NF-kB、VEGF及IL-10与本病相关,其中IL-6被认为是导致CD发生、发展的最重要细胞因子,血清IL-6水平与全身系统炎症症状及脏器损害呈正相关,治疗后血清IL-6水平会下降,与全身症状好转相对应。细胞因子增高的原因仍有待阐明,可能致病因素有病毒感染、副肿瘤综合征和自身免疫功能紊乱等。通常认为肿瘤的发生发展由多基因参与、多因素影响的,但其主要原因之一是由体细胞突变引起。分析这些突变的主要挑战是,要把对癌症发展有重要意义的少数功能性驱动突变,与大量对于疾病无关的随机乘客突变区分开。同样,癌症也是一种通路疾病(相互作用的基因组),并且据推测,驱动体突变针对的是数量相对较少(6-10个)的信号通路和调节通路中的基因,每个通路都包含大量的基因,重大突变基因的鉴定对于发现驱动程序突变及对癌症的靶向治疗至关重要。近年来,二代测序技术(NGS)的广泛应用对各种复杂疾病研究都发挥着重要作用,其通量高、成本相对较低,已被广泛应用于临床实践。二代测序方法中全基因组测序(WGS)、全外显子组测序(WES)和靶向基因测序是最为常用的方法。研究表明,外显子约占人全基因组的1-2%,却包含了 85%的致病突变。全外显子测序(Whole-exome sequencing,WES)是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法,该技术已经应用到多种疾病的基因诊疗中。WES相比WGS而言,主要关注与疾病相关的基因外显子区域,因此测序量降低,而测序深度提高,使得能够在较低的成本下发现突变,且结果更加可靠。而靶向深度测序则对测序深度更进一层,在捕获突变率及明确突变类型上有较强的优势。目前有报道的通过NGS在CD中的测序结果显示,在UCD中发现了 ETS1,PTPN6和TGFBR2的共同扩增。iMCD病例有DNMT3AL295Q体细胞突变。有1例UCD透明血管型变异的病例中发现了 6p号染色体上组蛋白基因簇的扩增,另外在肿瘤抑制因子和染色质结构重塑蛋白中显示出突变和拷贝数变化。这些研究对CD的研究带来了一些帮助,但是对于CD的发生发展等仍需大量的实验去证实,尤其是分子发病机制。研究发现,CD患者血清标本和淋巴结标本中IL-6表达上调。IL-6的功能有诱导B细胞增殖和血管内皮生长因子(VEGF)表达,从而可导致CD患者淋巴结生发区血管过度增生。血小板衍生生长因子受体(platelet derived growth factor receptor,PDGFR)一种酪氨酸蛋白激酶(TK)受体,位于细胞膜表面,是血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)蛋白质家族的受体,在细胞外信号转导到细胞中至关重要,并介导许多过程,如细胞增殖、分化、存活和迁移,在各种组织和器官的发育和再生中起着至关重要的作用。PDGF与PDGFR结合触发受体的二聚复合物形成,从而激活下游信号分子产生一系列生物效应,可诱导肿瘤新生血管的形成,直接或间接地促进肿瘤细胞增殖或转移,是肿瘤血管发生过程中起重要作用的信号通路。目前已有研究表明,在乳腺癌、胃癌、肺癌、多发性骨髓瘤等多种肿瘤中发现了 PDGFR的表达异常。由于CD的发病率较低,缺乏大样本的临床、实验室检测、预后因素及治疗方案的比较,使CD的诊断、治疗和管理面临挑战,须要深入了解其临床特点、免疫表型、病理机制及治疗方向,才能更准确的对其诊断及治疗。目前仍需要更多的研究来进一步探讨及验证相关问题。本研究对75例CD患者进行了全外显子组测序,发现了 PDGFRB基因在UCD中有较高的突变率,分析了其突变的相关信息,并构建了 PDGFRB的野生型及突变型质粒对其相关致病机制做了初步的探究,希望对CD的发病机制及临床诊疗提供新思路。2 目的探索PDGFRB在单中心Castleman病中的突变情况,并对PDGFRB的相关致病机制做初步的探究。3 方法3.1 研究对象本研究共收集了在1998年1月1日至2016年12月31日期间,来自郑州大学第一附属医院等多家医院的75名CD患者(41例UCD和34例iMCD)。在诊断时,所有病例均由两名经验丰富的病理学家独立检查和解释,并根据2015年NCCN Castleman病诊疗指南进行诊断,并排除了伴有恶性肿瘤、HIV感染、多发性神经病、器质性肿大、内分泌病、M蛋白和皮肤色素沉着综合症的患者,以及没有足够临床数据的患者。该研究经郑州大学第一附属医院机构审查委员会的批准进行。所有患者均获得书面知情同意书。3.2 研究方法3.2.1 对发现队列进行全外显子测序和验证队列进行靶向深度测序,从而确定突变基因及其突变位点3.2.1.1.将75例病人分为发现队列及对照组,发现队列共有40例(8例UCD,22例iMCD),验证队列共有35例(23例UCD,12例iMCD)。首先对发现队列的40例患者石蜡肿瘤组织DNA提取,获得DNA后,进行电泳、DNA浓度的测量以及标化,使其符合靶向深度测序的标准。进行测序后对结果进行分析。3.2.1.2.根据发现队列40例患者的全外显子测序结果,对35例验证队列的患者进行石蜡组织DNA提取,获得DNA后,进行电泳、DNA浓度的测量以及标化,使其符合靶向深度测序的标准。进行测序后对结果进行分析。3.2.1.3.对PDGFRB突变与UCD患者临床特征之间的关系进行分析,分析指标包括年龄、性别、UCD/iMCD分类、组织病理学特征、病灶定位、B症状、发热、水肿/腹水、乏力、低血红蛋白、LDH、低白蛋白血症、肝脾肿大。3.2.2 PDGFRB突变对细胞的影响3.2.2.1.通过对PDGFRβ胞质域的构象的建模,去探究PDGFRB的突变对受体活性的潜在影响。3.2.2.2.通过免疫共沉淀、蛋白印迹方法去分析测试了是否持续激活了受体酶活性,并通过荧光素酶检测、焦点形成实验来检测PDGFRB Asn666Ser突变体对细胞增殖的影响。3.2.2.3.通过Ba/F3细胞中非依赖细胞因子生长测定实验,来观察PDGFRB Asn666Ser突变体对细胞功能影响。3.2.2对PDGFRB p.Asn666Ser突变的体细胞起源的推测为了推测PDGFRB p.Asn666Ser突变的体细胞起源,我们运用了 BaseScope技术——一种在福尔马林固定石蜡包埋的UCD组织样品中进行的新型突变特异性RNA原位杂交。4研究结果4.1.血小板衍生的生长因子受体b(PDGFRB)在UCD中突变率最高4.1.1对75名CD患者(41例UCD和34例iMCD)的全外显子测序结果显示,有17%的UCD(7/41)患者有PDGFRB p.Asn666Ser突变,并且全部都是透明血管变异。4.1.2.比较不同癌症中PDGFRB突变的频率,发现UCD在所有癌症中PDGFRB突变的发生率最高,而且在其他血液肿瘤中未发现编码p.Asn666Ser的PDGFRB突变。4.1.3.PDGFRB突变与UCD患者临床特征,如年龄、性别、UCD/iMCD分类、组织病理学特征、病灶定位、B症状、发热、水肿/腹水、乏力、低血红蛋白、LDH、低白蛋白血症、肝脾肿大,无明显的关联。4.2.PDGFRB Asn666Ser 突变持续活化 PDGFRB 受体。4.2.1.通过对PDGFR β胞质域的构象建模,我们发现在PDGFRβ模型中,Asn666的侧链参与与His661主链的氢键相互作用,在自抑制形式的KIT激酶结构中,Asn655和His650之间观察到类似的相互作用。但是,在活性形式的KIT激酶中,Asn655的侧链指向不同的方向,并且不再与残基His650相互作用。因此,PDGFR β中p.Asn666ser将消除Asn666与His661之间的相互作用,可改变该蛋白区域中的相互作用。4.2.2.PDGFRB Asn666Ser突变体较野生型拥有较强的自磷酸化作用,可持续性活化PDGFRβ。萤光素酶报告基因测定法显示,与未刺激的野生型PDGFRβ相比,Asn666Ser突变体持续性激活SRE依赖性转录。4.2.3.与野生型PDGFR β转染的NIH3T3成纤维细胞细胞相比,用Asn666Ser突变体转染的细胞形成灶的能力明显增强了。在小鼠Ba/F3细胞的实验中,Asn666Ser突变体使小鼠Ba/F3细胞产生了不依赖IL-3的生长的特性。这些数据表明,Asn666Ser突变体具有转化细胞的潜力。4.3.PDGFRB p.Asn666Ser突变可能来源于UCD中的非造血基质细胞通过BaseScope RNA原位杂交测定,仅在CD45-细胞中可以检测到BaseScope信号,而CD45-细胞中富含非造血基质细胞。从而推断,PDGFRB p.Asn666Ser突变可能来源于UCD中的一群非造血基质细胞。5结论(1)PDGFRB基因在UCD中存在较高的突变率,并通过持续活化PDGFR β来促进细胞增殖与转化。(2)PDGFRB p.Asn666Ser突变可能来源于UCD中的非造血基质细胞,这仍需要进一步的研究。