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弓形虫是一种细胞内寄生性原虫,由其引发的弓形虫病感染宿主广泛,包括人在内的哺乳动物和鸟类。弓形虫感染在世界范围内均有发生,据报道全球约有三分之一的人口被弓形虫感染。虽然大多数弓形虫感染是无症状的,但是一些感染者可能会出现淋巴结,视神经和中枢神经系统的病理性症状的改变。此外,原发性弓形虫感染的孕妇可能感染胎儿导致先天性疾病,免疫功能低下的人感染弓形虫可能危及生命。犬、猫、猪、牛、羊等家畜感染弓形虫非常普遍,其感染率高达10%~47.3%,不仅造成家畜流产,影响畜牧业生产,而且成为人类弓形虫病的主要传染源,弓形虫病已成为我国亟待解决的重要公共卫生问题之一。然而,弓形虫病仍然没有理想的预防疫苗和治疗药物。因此,寻找有效的疫苗候选抗原或药物靶标,成为目前弓形虫防控研究的关键。致密颗粒蛋白GRAs作为弓形虫的主要排泄分泌抗原(ESA)成分,不仅在诱导宿主产生保护性免疫应答方面起重要作用,而且修饰纳虫泡膜结构,参与纳虫泡膜网络(Intravacuolar network,IVN)形成,保护虫体在细胞内的存活与增殖。GRA12是新近发现的一种致密颗粒蛋白,本研究通过对GRA12基因的克隆表达与免疫原性分析,发现GRA12作为弓形虫致密颗粒蛋白家族的一种重要分泌型蛋白,具有潜在的免疫原性,具体内容如下:GRA12基因的生物信息学分析通过生物信息学软件GENERUNR、DNAStar、DNAMAN及Expasy对GRA12序列的编码区进行分析,对该基因编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜结构域、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等信息进行预测。结果显示GRA12基因全长1311 bp,编码436个氨基酸,理论分子质量约为47.8 kDa,无信号肽,蛋白性质稳定为亲水性氨基酸,存在6个跨膜区以及15个潜在的抗原表位,预测GRA12具有较好的免疫原性。弓形虫GRA12克隆、表达与纯化利用Gen Bank发表的弓形虫RH株GRA12序列设计一对特异性引物,并在其上下游分别加入SacⅠ和HindⅢ酶切位点。提取弓形虫总RNA,RT-PCR扩增目的基因,连接到pMD18-T载体上,经过酶切鉴定以及测序分析,获得阳性克隆株。提取质粒,酶切后目的片段连接到pET-28a(+)载体,构建原核表达载体pET-28a-GRA12,转化到E.coli(DE3),经IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定,经镍柱亲和层析纯化,获得重组GRA12蛋白。弓形虫免疫原性研究将昆明小鼠随机分成三组,即GRA12重组蛋白免疫组,佐剂对照组和空白对照组。免疫后对不同时间段的小鼠采血并收集血清,通过酶联免疫吸附试验测定血清中免疫球蛋白的含量。免疫一周后收集小鼠脾细胞,通过流式细胞检测小鼠脾淋巴细胞中CD3,CD4及CD8的值及相互的比值关系;通过间接ELISA法检测小鼠细胞因子IL-12和TNF-α。最后,对免疫小鼠注射弓形虫RH速殖子验证重组蛋白的免疫原性及免疫保护性。结果显示,GRA12重组蛋白诱导小鼠产生高水平的IL-12和TNF-α;免疫组小鼠CD4和CD4/CD8的值与对照组显著升高;重组蛋白可延长小鼠生存时间。由此说明GRA12是免疫相关蛋白,本实验为弓形虫潜在药物靶点和疫苗候选抗原等方面的研究提供理论依据。