目的:白血病细胞耐药性是制约化疗成功的重要因素。特别是针对复发难治患者,常规化疗方案效果往往不能令人满意。如能在化疗前预先对白血病细胞的药物敏感性进行检测,并根据其结果优化治疗方案,可有效提高化疗成功率,延长患者生存时间。对于急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL),现有国内外研究提示,其对常规化疗药物的耐药是非常普遍的,因此,寻找一些药物增敏剂,减少白血病细胞对化疗药物的耐药性将会极大地改善患者的预后。目前,临床前肿瘤模型体内试验已证实蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)能够显著遏制包括多发性骨髓瘤、ALL在内的多种肿瘤细胞的生长、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制血管新生。此外,体外研究也显示硼替佐米可以增加化疗药的敏感性,并能克服骨髓瘤细胞对地塞米松、阿霉素和马法兰等药物的耐药。但迄今为止,硼替佐米能否在体外有效减少ALL细胞对化疗药物的耐药性,国内外尚缺乏相关报道。本研究拟通过体外试验检测原代ALL细胞对多种化疗药物的敏感性,来探讨其与临床化疗疗效的相关性,为临床治疗将体外药敏试验做为预后判断因素之一提供有力证据。同时结合现有的ALL预后分层指标对ALL患者的总体疗效和预后进行预测。此外,对于复发难治ALL,本研究拟将硼替佐米作为潜在的化疗增敏剂(一方面增加常规化疗药物的杀伤作用,另一方面逆转白血病细胞对化疗药物的耐药),来对比观察硼替佐米单药,硼替佐米+氟达拉滨+阿糖胞苷和硼替佐米+柔红霉素对耐药白血病细胞的作用,并探讨硼替佐米增加化疗药物抗肿瘤效应的具体作用机制,从而为临床治疗复发难治性ALL提供更多的联合化疗的选择方案,甚至为开发新型治疗策略提供相应理论依据。方法:1首先对36例初治ALL患者应用MTT法对单药及临床常用联合方案进行敏感性检测,了解其增殖抑制作用。结合ALL预后分层指标对ALL患者的化疗疗效和预后进行分析预测。2选取急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM/C1细胞(托泊替康耐药)为研究对象,应用不同浓度硼替佐米对CEM/C1细胞进行增殖抑制检测,并分别选取①0.36ug/ml的硼替佐米②0.49ug/ml的柔红霉素③0.36ug/ml的硼替佐米联合0.49ug/ml的柔红霉素对CEM/C1细胞进行增殖抑制检测。3选取急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM/C1细胞(托泊替康耐药)为研究对象,应用①0.36ug/ml的硼替佐米②158.5ug/ml的氟达拉滨③19.5ug/ml的阿糖胞苷④158.5ug/ml的氟达拉滨、19.5ug/ml的阿糖胞苷两药联合⑤0.36ug/ml的硼替佐米、158.5ug/ml的氟达拉滨、19.5ug/ml的阿糖胞苷三药联合对CEM/C1细胞进行增殖抑制检测。4选取难治性ALL患者的原代新鲜细胞,应用不同浓度硼替佐米、硼替佐米单药、氟达拉滨单药、阿糖胞苷单药、柔红霉素单药及氟达拉滨联合阿糖胞苷、硼替佐米+氟达拉滨+阿糖胞苷三药联合、硼替佐米+柔红霉素两药联合对其进行增殖抑制检测,并对其相互间疗效及与传统化疗方案疗效进行对比。5用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,所有数据用三次独立实验的平均值表示,实验结果用均数±标准差(X±S)表示;两组均数比较采用t检验,方差分析方法进行分析处理,多组均数比较用单因素方差分析,组间多重比较用SNK法。P<0.05有统计学意义。单因素分析、两个或多个率的比较采用卡方检验。多因素分析采用Logistic回归分析。以P<0.05作为具有统计学意义的标准。结果:1联合药物在初治ALL原代细胞中抑制作用及临床疗效相关性。1.1用苔盼蓝拒染试验方法测定ALL原代新鲜细胞活细胞率为95%-99%之间,平均活细胞率为(97.16±1.31)%,而冻存复苏后细胞活细胞率为67%-89.99%之间,平均活细胞率为(82.85±5.62)%,表明细胞冻存复苏后细胞活性下降,具有统计学意义(P<0.05)。1.2体外联合药敏与体内敏感性关系,体外敏感者31例,体外耐药者5例,体内敏感者31例,体内耐药者5例。体外药敏结果与体内疗效比较,S/S 30例,S/R 1例,R/S 1例,R/R 4例,总符合率为94.44%,阳性符合率为96.77%,阴性符合率为80%。ALL原代新鲜细胞单药及联合用药抑制率与冻存复苏后活细胞抑制率相比具有统计学差异(P<0.05)。1.3体外各联合化疗方案敏感组与耐药组细胞抑制率比较,VCTD方案敏感组平均抑制率为(61.32±7.88)%,耐药组平均抑制率为(28.65±1.81)%,VCID方案敏感组平均抑制率为(62.34±7.97)%,耐药组平均抑制率为(27.24±2.24)%,VCILD方案敏感组平均抑制率为(63.07±7.39)%,耐药组平均抑制率为(28.69±0.99)%,具有统计学差异。1.4将敏感组(S/S)和耐药组(R/R)的完全缓解率进行卡方检验,结果显示两组间的完全缓解率具有统计学差异(P=0.000),将敏感组(S/S)和耐药组(R/R)的复发率进行卡方检验,结果显示两组间的复发率具有统计学差异(P=0.011)。1.5将敏感组(S/S)和耐药组(R/R)的年龄(≥40岁)、初治时白细胞计数(T-ALL WBC≥100×109/L,B-ALL WBC≥30×109/L)、是否存在髓外病变、是否有复杂核型、预后分层危度组别(低危、高危)、缓解率、复发率进行单因素分析,结果提示年龄、初治时白细胞计数、预后分层危度组别、缓解率及复发率与化疗敏感与否有关(P<0.05)。将单因素分析结果有统计学意义的指标进行赋值,并进行Logistic多因素回归分析,结果提示:年龄、初治时白细胞计数、预后分层危度组别(P<0.05)为患者化疗是否敏感的独立危险因素。2单药或联合用药对急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM/C1细胞(托泊替康耐药)增殖的影响2.1试验中选取24.5ug/ml的托泊替康验证CEM/C1细胞耐药性,实验结果表明,其抑制率为(15.02±2.46)%。2.2试验中选取不同浓度硼替佐米(0.025ug/ml、0.25ug/ml、2.5ug/ml)作用于CEM/C1细胞48h,各组抑制率分别为(24.51±1.98)%、(44.17±1.16)%、(55.02±2.46)%,实验结果表明硼替佐米对急性T淋巴细胞白血病CEM/C1细胞株的增殖有抑制作用,且呈剂量依赖性,随着作用浓度的升高,抑制率也升高,有统计学意义(P=0.00)。2.3试验中选取①0.36ug/ml的硼替佐米②0.49ug/ml的柔红霉素③0.36ug/ml的硼替佐米联合0.49ug/ml的柔红霉素作用于CEM/C1细胞株48h,各组抑制率(44.46±1.61)%、(43.59±2.04)%、(54.94±1.06)%,三组具有统计学差异。2.4试验中选取①0.36ug/ml的硼替佐米②158.5ug/ml的氟达拉滨③19.5ug/ml的阿糖胞苷④158.5ug/ml的氟达拉滨、19.5ug/ml的阿糖胞苷两药联合⑤0.36ug/ml的硼替佐米、158.5ug/ml的氟达拉滨、19.5ug/ml的阿糖胞苷三药联合作用于CEM/C1细胞株48h,各组抑制率(44.46±1.61)%、(38.02±1.29)%、(24.59±2.89)%、(45.64±1.08)%、(56.09±2.14)%,五组具有统计学差异。3单药或联合用药对难治性ALL原代细胞增殖的影响3.1试验中选取不同浓度硼替佐米(0.025ug/ml、0.25ug/ml、2.5ug/ml)作用于三组难治性ALL原代细胞48h,各组抑制率分别为A组(24.78±1.84)%、(44.98±1.04)%、(55.79±3.07)%,B组(26.26±2.91)%、(44.99±0.65)%、(55.40±3.19)%,C组(25.73±1.56)%、(45.34±1.28)%、(57.73±3.43)%,实验结果表明硼替佐米对难治性ALL原代细胞的增殖有抑制作用,且呈剂量依赖性,随着作用浓度的升高,抑制率也升高,有统计学意义(P=0.00)。3.2硼替佐米组与非硼替佐米组对难治性ALL原代细胞增殖的影响3.2.1①0.36ug/ml的硼替佐米,②0.49ug/ml的柔红霉素,③0.36ug/ml的硼替佐米联合0.49ug/ml的柔红霉素,分别作用于六组难治性ALL(A,B,C,D,E,F)原代细胞48h,实验结果表明硼替佐米组较非硼替佐米组具有统计学差异。3.2.2①0.36ug/ml的硼替佐米②158.5ug/ml的氟达拉滨③19.5ug/ml的阿糖胞苷④158.5ug/ml的氟达拉滨、19.5ug/ml的阿糖胞苷两药联合⑤0.36ug/ml的硼替佐米、158.5ug/ml的氟达拉滨、19.5ug/ml的阿糖胞苷三药联合,分别作用于六组难治性ALL(A,B,C,D,E,F)原代细胞48h,实验结果也表明硼替佐米组较非硼替佐米组具有统计学差异。3.3传统用药与新方案对难治性ALL原代细胞增殖的影响试验中选取①VCTD,②VCID,③VCILD,④0.36ug/ml的硼替佐米、158.5ug/ml的氟达拉滨、19.5ug/ml的阿糖胞苷三药联合,⑤0.36ug/ml的硼替佐米联合0.49ug/ml的柔红霉素,分别作用于六组复发的难治性ALL(A,B,C,D,E,F)原代细胞48h,实验结果表明传统联合化疗方案与试验方案抑制率具有统计学差异。结论:1进行MTT体外药敏试验选用的ALL患者的原代细胞需为新鲜细胞,冻存复苏后的细胞活力差,抑制率较新鲜细胞有统计学差异,影响MTT试验结果。2 MTT体外药敏试验与体内疗效的符合性较高,可以用于指导临床ALL进行个体化治疗选择联合化疗方案的手段。3对于体外药敏实验敏感的ALL患者应用常规化疗方案治疗效果较好,而体外药敏实验耐药的ALL患者应用常规传统化疗治疗效果差,临床需调整治疗方案。特别是对于初治时年龄大,白细胞计数高及预后危险度分层高的患者,化疗敏感性可能较差,需优化化疗方案。4急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM/C1细胞(托泊替康耐药),硼替佐米联合柔红霉素,硼替佐米联合氟达拉滨、阿糖胞苷应用时均具有增敏效果。5硼替佐米为主的联合化疗方案可以提高难治复发ALL患者的缓解率。