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糖尿病周围神经病变（Diabetic peripheralneuropathy,DPN）是1型糖尿病和2型糖尿病最为常见的慢性并发症,约50%的糖尿病患者最终会发生DPN。DPN的临床症状主要表现为对称性疼痛、感觉异常、运动和自主神经功能障碍等,并可能最终导致下肢截肢。DPN的病因和发病机制尚未完全阐明,目前认为主要与高血糖、脂代谢紊乱以及胰岛素信号通路异常所导致的一系列病理生理变化相关,其中包括多元醇途径、糖酵解途径、己糖胺途径、晚期糖基化终末产物途径、Toll样受体4信号转导通路、氧化低密度脂蛋白受体1信号通路等,单独或共同作用导致细胞Na+-K+-ATP酶表达下调、内质网应激、线粒体功能障碍、DNA损伤、炎症信号增强及炎症因子水平升高。芪红通痹方由红花、黄芪、丹参、没药和甘草五味中药组成,组方来源基于前期临床数据挖掘和网络药理学的实验结果,我们预测芪红通痹方具有良好的治疗DPN的效果,但未对其药效进行验证,且作用机制尚未进行研究。为此,本课题通过动物实验,验证芪红通痹方的药效,并利用网络药理学、代谢组学、肠道菌群测序相结合的方式,探究芪红通痹方治疗DPN的作用机制。目的:首先通过芪红通痹方治疗DPN的药效学研究,证实芪红通痹方对DPN的有效性;接着,运用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS分析芪红通痹方的入血成分,采用网络药理学的方法对芪红通痹方中有效成分的作用靶点、潜在的DPN靶点以及相关通路进行研究,探究芪红通痹方治疗DPN的作用机制;然后从血清代谢组学的角度探究芪红通痹方对于DPN的代谢调控机制;最后运用16S rDNA测序技术研究芪红通痹方对肠道菌群的调控作用,并以非靶向代谢组学技术探究芪红通痹方调节肠道菌群稳态所涉及的主要代谢通路。方法:1芪红通痹方治疗DPN的药效学研究雄性C57BL/6J-ob/ob小鼠满足高血糖条件者随机分为6组:模型组（Model）、木丹颗粒组（Mudan granules,MDG）、芪红通痹方水提物高剂量组（Qihongtongbi prescription water extract high dose group,W-H）、芪红通痹方水提物低剂量组（Qihongtongbi prescription water extract low dose group,W-L）、芪红通痹方醇提物高剂量组（Qihongtongbi prescription ethanol extract high dose group,E-H）、芪红通痹方醇提物低剂量组（Qihongtongbi prescription ethanol extract low dose group,E-L）,另取 10 只正常的C57BL/6J小鼠为空白组（Control）。测定各组小鼠的机械痛阈（Mechanical withdrawal threshold,MWT）,模型组及各给药组与空白组有显著性差异则表示DPN模型成功。除空白组饲喂SPF大小鼠维持饲料外,其余6组饲喂高脂饲料。适应性饲养1周后,各组开始持续按照0.1 ml/10g灌胃给予相应药物,空白组和模型组给予蒸馏水。给药后每周测一次小鼠空腹血糖（Fasting Blood Glucose,FBG）;给药4周后测小鼠糖化血红蛋白（Haemoglobin A1C,HbA1C）;末次给药后,测定小鼠机械痛阈（Mechanical withdrawal threshold,MWT）和坐骨神经传导速度（Nerve conduction velocity,NCV）。给药9周后,解剖取小鼠坐骨神经组织,采用HE染色观察神经形态变化。2芪红通痹方治疗DPN的网络药理学研究利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技术鉴定芪红通痹方的主要入血成分。基于网络药理学,将化合物录入ChEMBL、中药综合数据库（TCMID）数据库筛选成分靶点;借助治疗靶标数据库（TTD）和疾病相关的基因与突变位点数据库（DisGeNET）,通过检索关键词“diabetic peripheral neuropathy”筛选疾病靶点;运用基因本体论（Gene Ontology,GO）数据库和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）数据库对芪红通痹方和DPN共有靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析;利用STRING 11.0构建芪红通痹方治疗DPN的“成分-靶点-通路”网络。3芪红通痹方治疗DPN的血清代谢组学研究运用 UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技术检测 Control 组、Model 组、W-L 组、MDG组血清代谢物。采用多元统计分析和单变量统计分析相结合的方式,根据变量权重值（Variable important in projection,VIP）＞1和P＜0.05的标准筛选差异代谢物。运用KEGG数据库对差异代谢物进行通路富集分析。4芪红通痹方治疗DPN的肠道菌群研究运用16S rDNA测序技术对Control组、Model组、W-L组（QHTB组）、MDG组连续干预9周后的盲肠内容物进行微生物多样性分析,分析肠道菌群的结构与功能。5芪红通痹方治疗DPN的粪便代谢组学研究运用 UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技术检测 Control 组、Model 组、W-L 组、MDG组小鼠盲肠内容物代谢物。采用多元统计分析和单变量统计分析相结合的方式,根据变量权重值（Variable important in projection,VIP）＞1和P＜0.05的标准筛选差异代谢物。运用KEGG数据库对差异代谢物进行通路富集分析。结果:1芪红通痹方治疗DPN的药效学研究与Control组比较,Model组小鼠FBG（P＜0.01）和HbA1C（P＜0.05）显著升高,MWT（P＜0.01）和NCV（P＜0.01）显著降低,坐骨神经纤维松散无序,神经纤维的髓鞘变薄。与Model组相比,芪红通痹方各给药组FBG显著降低（P＜0.01,P＜0.05）,HbA1C 显著降低（P＜0.01,P＜0.05）,MWT 显著升高（P＜0.01）,NCV显著升高（P＜0.01）,神经纤维整齐紧凑。2芪红通痹方治疗DPN的网络药理学研究芪红通痹方在正负离子模式下共检测出18个入血成分,有效成分的作用靶点211个,DPN靶点共125个。芪红通痹方治疗DPN的关键活性成分包括没食子酸、香草酸等,GO功能富集分析结果包括713个生物过程,16个细胞组分,61个分子功能（P＜0.05）,涉及的生物过程主要血管生成、血管发育及血管内皮细胞迁移的正向调节等;细胞组分主要有雪旺细胞微绒毛等;分子功能主要有G蛋白偶联受体结合、钠转运ATP酶活性-磷酸化机制、胰高血糖素样肽-1受体活性等。KEGG通路富集分析共得到195条通路,主要涉及脂质和动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、糖尿病并发症中的 AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway indiabetic complications）等。3芪红通痹方治疗DPN的血清代谢组学研究10种代谢物的含量表达变化被芪红通痹方逆转,其中PC（16:0/20:4（8Z,11Z,14Z,17Z））和Indoleacetaldehyde的表达被促进,LysoPC（22:5（7Z,1 0Z,13Z,16Z,19Z））,LysoP C（20:5（5Z,8Z,11Z,14Z,17Z））,5-Aminopentanoic acid,N1-methyl-2-pyridone-5-carboxami de,Dihydroferulic acid 4-sulfate,trans-Cinnamic acid,L-Norleucine 和 3a,6a,7b-Trihydro xy-5b-cholanoic acid的表达被抑制。6种代谢物的表达抑制与木丹颗粒的干预有关,包括 Dihydroferulic acid 4-sulfate,L-Norleucine,3a,6a,7b-Trihydroxy-5b-cholanoic acid,Tri chloroethanol glucuronide,D-Glucose 和 D-Maltose levels。芪红通痹方调控的代谢物主要富集于癌症中的胆碱代谢通路（choline metabolism in cancer）（P＜0.01）、甘油磷脂代谢通路（glycerophospholipidmetabolism）（P＜0.01）、逆行内源性大麻素信号通路（retrograde endocannabinoid signalling）（P＜0.05）和亚油酸的代谢通路（linoleicacidmetabolism）（P＜0.05）。木丹颗粒调控的代谢通路主要富集于碳水化合物的消化吸收（carbohydrate digestionandabsorption）（P＜0.05）、糖酵解/糖异生（glycolysis/gluconeogenesis）（P＜0.05）、磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway）（P＜0.05）以及淀粉和蔗糖代谢（starchandsucrosemetabolism）（P＜0.05）。4芪红通痹方治疗DPN的肠道菌群研究在门水平上,DPN模型显著引起肠道菌群物种组成改变,肠内拟杆菌门的丰度减少,疣微菌门的丰度减少,厚壁菌门的丰度增多。芪红通痹方干预能够有效逆转这些变化,使得拟杆菌门的丰度增加,疣微菌门的丰度增加,厚壁菌门的丰度减少,说明芪红通痹方能够使得DPN小鼠的肠道菌群趋于正常菌群的结构。5芪红通痹方治疗DPN的粪便代谢组学研究在肠道差异代谢物富集的通路方面,Model组对Control组的差异得分图显示,花生四烯酸代谢（P＜0.01）、神经活动配体-受体的交互作用（P＜0.01）、胆汁分泌（P＜0.01）、酪氨酸代谢（P＜0.05）和亚油酸的代谢（P＜0.01）等通路注释到的所有差异代谢物的表达趋势均上调。QHTB对Model组的差异得分图显示,花生四烯酸代谢（P＜0.01）、亚油酸的代谢（P＜0.01）和维生素B6的代谢（P＜0.05）通路上的差异代谢物整体表达趋势下调,氧化磷酸化（P＜0.05）通路的差异代谢物整体表达趋势下调。结论:1.芪红通痹方对DPN有良好的治疗作用,可以从镇痛和控制血糖两方面发挥疗效。2.芪红通痹方可能通过调控逆行内源性大麻素信号通路来发挥镇痛作用。3.芪红通痹方可能通过促进亚油酸等短链脂肪酸与G蛋白偶联受体结合来抑制脂肪合成,通过促进胰高血糖素样肽1的分泌来增加周围组织对胰岛素的敏感性,改善胰岛素抵抗。4.芪红通痹方可能通过调控维生素B6及其代谢物的表达,保护Na+-K+-ATP酶活性,从而减少血管损伤导致的神经退行性改变。5.芪红通痹方通过对特定的肠道微生物群进行调控,恢复肠道菌群的结构,维持DPN小鼠的血糖稳态,改善胰岛β细胞的功能。