2013年,美国癌症学会公布了评估报告,预计该年有228190例新增肺癌患者并有159480例患者将因肺癌死亡,分别占世界总数的13.7%以及27.5%。肺癌依旧占据着导致癌症死亡病因的第一位。尽管在近三十年来肿瘤化疗方案有着巨大的进步,肺癌的五年生存率仍仅有17%。新的能够有效治疗这种高侵袭性癌症的方案亟待被人们发现。许多年前肿瘤干细胞假说就已经被人们提出。这种假说认为肿瘤的发生起源于一些自我更新机制调节失常的组织干细胞。一些肿瘤细胞仍旧保留着干细胞特性,包括自我更新以及分化的能力。这些具有干细胞特性的肿瘤细胞被称为肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs),其被认为涉及到肿瘤发生以并与肿瘤的发展及转移有着密切关系。值得注意的是,与普通肿瘤细胞相比,针对肿瘤干细胞的治疗效果甚微。肿瘤干细胞对常规的抗肿瘤治疗表现出明显的耐受能力。一些ATP结合盒转运蛋白在这些细胞内有着较高的表达。此类转运蛋白如ABCG1, ABCB1以及ABCC1等能够主动的将药物从细胞内外排出去。因此,尽管放化疗能够有效杀灭并消除肿瘤,但是仍有足够数量肿瘤干细胞存活并导致肿瘤复发。在这种情况下,找到专门针对肿瘤干细胞的新治疗方法或许可以显著提高肿瘤化疗的效果。CD133是一种被广泛认可的肿瘤干细胞表面标记物,在许多肿瘤研究包括肺癌中用于分离得到肿瘤干细胞。如果肿瘤干细胞真的起源于普通干细胞,那么调节普通干细胞自我更新以及分化的信号通路可能在肿瘤干细胞中起到类似的作用。Notch信号通路被认为在细胞发育及细胞结局中扮演着重要的角色。一些研究表明在许多癌症的发生过程中观察到了Notch通路的功能障碍。此外,大多数的肺癌细胞株都有Notch通路受体及其靶基因的表达,如Jaggedl, Hesl and Heyl。 Notch信号传导的抑制能够降低肿瘤细胞的增殖。目的：为了探讨Notch信号通路在肿瘤干细胞中的调节作用,我们从人肺腺癌细胞系A549中分离得到CD133阳性细胞。比较Notch信号通路在CD133阳性及CD133阴性细胞中表达差异,并使用Y分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号传导。通过检验肿瘤干细胞对顺铂的耐药性以及DAPT对其耐药性的影响,来判断Notch信号通路是否在肿瘤干细胞的靶向治疗研究中具有重要意义。方法：1.我们使用CD133作为肿瘤干细胞表面标志物,采用流式细胞分选技术从人人肺腺癌细胞系A549中分离得到肿瘤干细胞。A549细胞使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行培养。将培养得到的A549细胞通过FcR处理阻断其特异性结合,并用藻红蛋白(PE)结合的CD133/2抗体进行标记,之后通过高速流式分选细胞仪分选得到CD133阳性细胞。所获得的的CD133阳性细胞使用含有表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)以及碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF)的无血清培养基进行培养,可抑制其分化。随后检测其生物学特性如形态,自我更新能力,增殖能力以及耐药能力等。CCK-8试剂盒用以测量CD133阳性及CD133阴性细胞的增殖能力,并通过测定不同时间点的吸光度值来绘制生长曲线。2.为了比较Notch信号通路在CD133阳性及CD133阴性细胞中的表达差异。我们通过实时荧光定量PCR (RT-PCR)以及Western Blotting来检测两种细胞内Notchl,Notch2以及Hesl的表达情况。信使RNA的表达通过比较Ct值来进行分析,actin作为内参对照.蛋白的表达情况则通过奥德赛红外成像系统进行检测,GAPDH用于数据的统一比较。γ分泌酶抑制剂DAPT(GSI-IX)用于阻断Notch信号通路的传导,以此研究其对CD133阳性及CD133阴性细胞的影响。本实验中,顺铂(CDDP)作为经典的肺癌化疗药物,被用于肿瘤细胞耐药性的检测。为了进一步研究Notch信号通路对CD133阳性及CD133阴性细胞耐药性的影响,以及检测γ分泌酶抑制剂同顺铂的联合应用效果,我们将2μM的DAPT和6mg/L的顺铂分别单独以及联合对肿瘤细胞进行药物干预。并通过CCK-8检测细胞活性,碘化丙啶(PI)染色检测细胞周期变化来评估其是否具有一定的协同作用。结果：1.我们将PE结合的单克隆CD133/2(293C3)抗体标记A549细胞,通过流式细胞仪依据其表面标记物CD133的表达进行分选。在普通A549细胞中,CD133仅表达于0.5%±0.12%的细胞。而在分选后得到的CD133阳性细胞中,这一表达比率为97.5%±1.72%。通过绘制的7天生长曲线,我们发现CD133阳性细胞及CD133阴性细胞的增殖速度无明显的差异。相较CD133阴性细胞,同样的顺铂干预浓度下,CD133阳性细胞表现出更强的耐药性。在CD133阴性细胞中,顺铂的半数抑制浓度为5.9±0.61mg/L,而在CD133阳性组则为21.1±0.97mg/L,这两种细胞对顺铂的耐药能力具有显著差异(P<0.01)。我们观察到5.75%±0.35%的CD133阴性细胞以及0.1%±0.02%的CD133阳性细胞处于G2/M期,这说明在大多数的CD133阳性细胞中DNA复制处于较不活跃的状态。而这种DNA复制的休止或许正是导致肿瘤干细胞具有较强耐药性的原因之一。2.RT-PCR显示Notch1及Notch2在CD133阳性和CD133阴性细胞中均有表达,但是在CD133阳性细胞中的表达水平较低(0.069±0.019与0.13±0.026)。Hes1则仅表达于CD133阴性细胞中。Western blotting结果与RT-PCR较为相似,(1.36±0.13vs0.40±0.08,1.01±0.20vs0.76±0.11, P<0.05)。我们观察到DAFT对两种细胞都具有较为轻微的增长抑制效果。在使用2μMDAPT干预48小时后,CCK-8分析提示CD133阴性细胞的生存率比较对照组为79.2%±4.3%,而CD133阳性细胞则为68.2%±3.8%,这一结果显示DAPT对CD133阳性细胞具有更强的抑制能力(P<0.05)。同时在CD133阴性组中,经DAPT干预后处于G2/M期的细胞比例为5.65%±0.44%,这与对照组的5.75%±0.35%无明显差异(P>0.05)。在CD133阳性组中该情况相同,实验组与对照组的比例分别为0.00%以及0.1%±0.02%。但是在CD133阳性细胞中,经干预后S期细胞的数量由11.96%±0.89%上升至18.48%±0.64%(P<0.05)。GSI与顺铂联合应用能够有效提升对肿瘤细胞化疗效果。当细胞使用6mg/L浓度的顺铂单独干预时,CD133阴性及CD133阳性细胞的生存率分别为43.5%±2.7%以及66.7%±4.2%。然而,当使用DAPT与顺铂联合干预时,这一数据降至35.3%±1.8%以及42.5%±2.1%。这一结果证实了我们的假设,即阻断Notch信号传导能够抑制A549细胞对化疗的耐药能力。此外,我们同样观察到这种抑制效果的增长在CD133阴性组为14%,而在CD133阳性组为55.6%,这使我们特别注意到该协同效应在CD133阳性细胞中更为显著。顺铂主要通过与DNA结合并干扰细胞的自我修复机制最终导致细胞死亡,而该作用仅在细胞的G2/M期才能有效实现。顺铂能够将A549细胞周期阻滞于G2/M期,当使用6mg/L的CDDP干预48小时后,CD133阴性组及阳性组G2/M期细胞比例分别上升至39.46%±1.84%与17.50%±0.77%。该结果证明CD133阳性细胞对顺铂的作用较CD133阴性细胞不为敏感(P<0.05)。对于CD133阴性细胞,单一顺铂干预与DAPT/顺铂联合干预对G2/M期的阻滞效果无明显差异(39.46%±1.84%and39.53%±1.08%,P>0.05)。然而DAPT/顺铂联合方案却能够显著提高CD133阳性细胞中的G2/M期阻滞情况。相较于顺铂组,其G2/M期细胞数量在DAPT/顺铂组由17.50%±±0.77%上升至38.41%0.93%(P<0.01),这一数值已与CD133阴性组较为接近。结论本研究表明γ分泌酶抑制剂能够对CD133阳性A549细胞的生长起到抑制作用,并且阻断Notch信号传导能够增强顺铂的化疗效果。此外,DAPT/顺铂联合疗法能够引起G2/M期阻滞并有效杀灭CD133阴性及CD133阳性细胞。而这一协同作用对CD133阳性细胞尤为显著。未来还需要进一步的研究来证明γ分泌酶抑制剂诱导的顺铂效果增强的机制。尽管如此,对于改进癌症治疗方案来说,针对Notch信号通路的靶向研究仍显示出了巨大的潜力。同时杀灭DNA复制活跃的普通肿瘤细胞以及处于更加静止状态的肿瘤干细胞,将能够减少肿瘤的复发。