冷害是指环境温度低至最适生长临界点以下时造成植物机体代谢和生理不可逆的伤害,水稻苗期冷害引起植株生长缓慢、死苗等现象,目前已经成为影响世界粮食稳定生产的自然灾害。因此,挖掘水稻耐冷种质资源,研究水稻耐冷分子机理以及提供可靠的分子标记辅助选择QTL位点,对培育水稻耐冷品种和保证粮食安全生产具有重要意义。本研究利用耐冷亲本东乡野生稻(O.rufipogon)与南京11(O.satavia)构建的BC2F1初步定位群体,以苗期幼苗存活率、叶片渗透势和根电导率为耐冷指标,通过复合区段法分别在第2、5、8、10染色体上定位到7个与耐冷相关的QTL。其中,与存活率相关的qPSR2-1、qPSR2-2位于第2号染色体上,LOD值分别为3.3、3.1,贡献分别为12.3%、9.8%。与叶片渗透势相关的qLOP2、 qLOP5、 qLOP8分别位于第2、5、8号染色体上,LOD值分别为3.8、4.3、5.1,贡献率分别为10.1%、8.8%、6.9%；与根电导率相关的qRC10-1、qRC10-2位于10号染色体上,LOD值分别为3.1、6.1,贡献率分别为9.4%、32.1%。qPSR2-1和qLOP2位于同一个区段内,两侧紧密连锁的分子标记为RM318和RM106。为深入研究贡献率大于>10%的QTL位点,分别构建了两个精细定位群体对qPSR2-1、qL0P2和社C10-2位点进行精细定位。通过发展覆盖qPSR2-1、 qLOP2位点的多态性分子标记(RM3793、RM3508、RM3512、RM221、RS3、 RS8、RS11),结合由11,326、8,642个单株组成的BC4F2、BC4F3精细定位群体,最终将qPSR2-1、qLOP2定位在39.3-kb范围内,两侧的标记为RM221和RS8。根据RAP 1.0数据库日本晴物理图谱,该区段内含有2个CBF3转录因子(Os02g0676800、Os02g0677300), Real-time PCR分析表明O50幻0677300在东乡野生稻中冷处理3h后表达量显著上升(尸<0.01),而Os02g0676800的表达量在整个冷处理过程中未出现明显的上升趋势。由此,Os02g0677300可能是qPSR2-1、 qLOP2最佳的候选基因。祁C10-2的精细定位群体由13,324个单株组成,通过发展覆盖该区段高密度的多态性分子标记(qc8、qc18、qc19、qc25、qc27、qc45、qc47、qc48、qc55、RM25628, RM25681),最终将qRC10-2定位至22.5-kb范围内,两侧的标记为qc47和qc48。测序东乡野生稻在qRC10-2区段的基因组序列表明,该区段仅存在一个开放读码框,转录后的全长cDNA为830bp,编码框包含642bp,5’UTR包含21个bp,3’UTR包含167个bp。与南京11对比,东乡野生稻编码框第343、524位置存在2个碱基的突变,东乡野生稻为‘G’、‘A’,相应的氨基酸为Gly、Asp,而南京11的碱基为‘A’、‘G’,相应的氨基酸转变为Ser, Gly。进一步分析38个粳稻和50个籼稻qRCI0-2区段编码框的序列,结果表明存在3种变异类型(G1、G2、G3组),变异都发生在编码框内,存在一个籼／粳特异性变异位点,东乡野生稻、粳稻编码框第343碱基为‘G’,而南京11和所有籼稻的为‘A。测定各组的根电导率值表明东乡野生稻和粳稻组G1具有较低的根电导率值,而南京11和籼稻组G2、G3的根电导率值均较高,两者之间存在显著差异(P<0.01)。qRC10-2与日本晴的Os10g0490100基因(果胶裂解折叠蛋白酶)高度同源, Real-time PCR结果表明qRC10-2在耐冷植株(东乡野生稻、L188)叶片中受冷胁迫后上调表达,根部表达量虽然不受冷胁迫诱导,但是qRC10-2在东乡野生稻、L188根部的表达量在冷胁迫之前就与南京11存在显著差异(P<0.01)。为了验证qRC10-2基因的生理功能,将东乡野生稻qRCI0-2的全长cDNA与UBI启动子连接构建载体转化冷敏感籼稻品种R6547,共获得23株T0转基因苗,收获该23个单株的T1种子进行耐冷性鉴定。在4℃/48h处理后恢复室温培养2天后,野生型R6547大部分植株完全枯萎,23个转基因株后代的存活率变化幅度从25%～95%,其中转基因株系S23大部分后代仍能保持正常生长状态,除了S1、S2株系的存活率为20%、25%外,其他转基因株系的存活率均在60%以上。由此可见,过表达qRC10-2可以提高植株抵御冷害的能力。此外,鉴定qRC10-2的BC5F3近等基因系(R1-2和R2-2)在成熟期的耐冷特性表明,无论人工冷水串溉(5℃)还是自然田间鉴定(夜间平均温度为12-15℃),R1-2和R2-2剑叶在低温胁迫后叶绿素含量显著高于不携带qRC10-2位点的南京11和近等基因系(R1-1和R2-1),无qRC10-2位点的植株低温胁迫后出现早衰枯萎,成熟后千粒重显著低于R1-2和R2-2。因此,qRC10-2位点是一个控制水稻苗期、成熟期耐冷的QTL位点,苗期可以降低冷害对根细胞膜的损伤,成熟期能保证籽粒正常灌浆成熟。本研究为揭示水稻耐冷的分子机理提供了理论基础,同时为分子标记辅助选育耐冷水稻品种提供了可靠的QTL位点。