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研究背景:结肠癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤,目前以手术切除为主,对于晚期并伴有转移时,化疗是最主要的治疗手段,但多药耐药(multidrug resistance,MDR)常导致疗效不理想。P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)高表达是产生MDR的主要因素之一,经典的P-gp抑制剂包括维拉帕米和环孢菌素A,而维拉帕米是抗心律失常药,环孢菌素A是免疫抑制剂,它们在增强化疗敏感性的同时会产生毒副效应。因此,亟待寻找一类与化疗药物联用后,能增强化疗药物的化疗敏感性且无明显毒副作用的药物。基于药食同源成分的低毒性,部分研究者更关注天然有机小分子化合物。槲皮素(Quercetin,Que)是一种多羟基黄酮类化合物,存在于多种植物中,具有广泛的药理作用,如抗肿瘤、抗炎,预防和治疗心脑血管疾病等作用。近些年的研究表明,槲皮素对多药耐药的逆转具有一定的成效,但槲皮素对多药耐药的结肠癌细胞SW620/Ad300的药理作用及其逆转机制未见相关报道。研究目的:本文旨在探究槲皮素调节阿霉素(Doxorubicin,Dox)抑制结肠癌多药耐药细胞SW620/Ad300增殖的药理作用,并从系统生物学角度研究槲皮素增强结肠癌细胞SW620/Ad300对阿霉素敏感性的分子机制。研究方法:(1)MTT实验:确定槲皮素、阿霉素的给药浓度;槲皮素对阿霉素化疗作用的影响。(2)凋亡实验:测定槲皮素对阿霉素诱导结肠癌亲本细胞SW620及其耐药细胞SW620/Ad300凋亡的影响。(3)阿霉素蓄积实验:测定槲皮素对结肠癌细胞SW620及SW620/Ad300胞内阿霉素蓄积的影响。(4)罗丹明123(Rhodamine123,Rho123)蓄积实验:测定罗丹明123在结肠癌细胞SW620及SW620/Ad300中的累积,评价槲皮素对P-gp转运活性的影响。(5)代谢组学:应用UPLC-MS/MS对细胞样品进行分析;使用OSI-SMMS软件对代谢物进行定性,同时采用MZcloud、HMDB对定性结果进一步确证;应用SIMCA软件筛选差异代谢物;通过MetaboAnalyst、KEGG网站进行相关通路分析,探究槲皮素逆转结肠癌耐药细胞MDR的分子机制。(6)人溶质载体家族 1 成员 5(Solute carrier family 1,member 5,SLC1A5)酶联免疫分析(ELISA)和谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)活性分析:测定槲皮素对结肠癌细胞SW620及SW620/Ad300中溶质载体家族1成员5的表达和谷氨酰胺酶活性的影响。(7)三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)和活性氧(Reactive oxygen,ROS)含量分析:测定槲皮素、阿霉素及两药联用对结肠癌细胞SW620及SW620/Ad300 中 ATP、ROS 水平的影响。实验结果:(1)MTT实验结果:梯度系列浓度的阿霉素分别作用于结肠癌细胞SW620与SW620/Ad300 48 h后,其IC50值分别为0.52±0.0018 μM和13.02±0.0035μM,耐药指数(resistant index,RI)为24.95;梯度系列浓度的槲皮素作用于结肠癌细胞 SW620 与 SW620/Ad300 48 h 后,其 IC50 值分别为 594.37±4.32 μM 和 652.32±3.86μM,表明单独使用槲皮素对亲本细胞与耐药细胞的作用无明显差异;33.00μM槲皮素与梯度系列浓度阿霉素联合作用于结肠癌细胞SW620与SW620/Ad300 48h后,其IC50值分别为0.52±0.0030μM、3.66±0.0024 μM,表明在作用于亲本细胞时,槲皮素对阿霉素的作用无明显影响,而在作用于耐药细胞时,槲皮素能明显增加结肠癌耐药细胞对阿霉素的敏感性,其耐药逆转倍数(reversal fold,RF)为 3.55。(2)凋亡实验结果:0.52 μM的阿霉素诱导45.36%的SW620细胞发生凋亡,然而其对耐药细胞的凋亡无明显影响;33.00 μM槲皮素与阿霉素联合作用48 h,与单用阿霉素组相比,结肠癌亲本细胞SW620的凋亡无明显变化,但结肠癌耐药细胞SW620/Ad300的凋亡明显增加。(3)阿霉素蓄积实验结果:P-gp高表达的耐药细胞中阿霉素含量显著低于亲本细胞;槲皮素能明显增加结肠癌耐药细胞SW620/Ad300胞内阿霉素的蓄积,但对结肠癌亲本细胞SW620胞内阿霉素的含量无明显影响。(4)罗丹明123蓄积实验结果:在槲皮素的作用下,结肠癌耐药细胞SW620/Ad300胞内罗丹明123蓄积增加,而结肠癌亲本细胞SW620胞内罗丹明123含量无明显改变。(5)基于UPLC-MS/MS的代谢组学技术研究结果:结肠癌细胞SW620与SW620/Ad300相比,鉴定出13个差异代谢物,包括异亮氨酸、柠檬酸、谷氨酸及谷氨酰胺等,参与的代谢通路有丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨酰基-tRNA生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢等;槲皮素作用于耐药细胞SW620/Ad300,7个代谢物发生显著改变,包括异亮氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、柠檬酸和N-乙酰天冬氨酸,通路分析显示D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢变化最为显著(P=3.94E-04,Impact=0.2834),表明槲皮素可能通过影响该代谢通路来逆转P-gp高表达引起的多药耐药。(6)SLC1A5酶联免疫分析和GLS活性分析结果:耐药细胞SW620/Ad300中SLC1A5的表达高于亲本细胞SW620,阿霉素对亲本及耐药细胞中SLC1A5的表达无影响,而槲皮素可抑制耐药细胞中SLC1A5的表达;SW620细胞与SW620/Ad300细胞中的GLS活性无明显差异,槲皮素对该酶活性无明显影响。(7)ATP和ROS分析结果:SW620/Ad300细胞中ATP水平显著高于SW620细胞,阿霉素可抑制SW620细胞中ATP的产生,但却刺激了耐药细胞中ATP微弱的上调,槲皮素与阿霉素联用能够降低耐药细胞中ATP的水平;0.52 μM的阿霉素诱导SW620细胞中ROS水平增加,但对耐药细胞无明显作用,与33.00μM槲皮素联用后,耐药细胞中ROS明显增加。结论:(1)槲皮素通过抑制P-gp的转运活性增加结肠癌耐药细胞SW620/Ad300胞内阿霉素的蓄积,从而增加阿霉素诱导的耐药细胞SW620/Ad300的凋亡。(2)槲皮素通过抑制谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5的表达抑制谷氨酰胺代谢,进而下调ATP水平抑制P-gp转运活性,从而增加胞内Dox并升高ROS的水平增强对耐药细胞SW620/Ad300的毒性作用,逆转耐药。