论文部分内容阅读
目的:四硫取代三苯甲基自由基（trityl,TAM）在磁共振波谱与成像领域已有广泛应用。CT-03和OX063是trityl的两个典型代表。文献已报道CT-03的大规模合成,因此,现有trityl自由基的结构修饰和功能衍生化主要基于CT-03母核。研究结果证实,CT-03衍生物能够测量各种生理参数,包括超氧阴离子自由基、pH、生物体内巯基化合物以及总氧化还原态。采用EPR脉冲偶极光谱,新型trityl自旋标记物可用于生理条件下蛋白质和核酸的距离测量。此外,trityl自由基在动态核极化领域也有很强的应用前景。尽管如此,CT-03及其衍生物的较高疏水性限制了它们在多个领域的应用。例如,CT-03与蛋白质如白蛋白之间存在较强的疏水相互作用。同时,CT-03在低介电常数环境（如生物膜）中,因其羧基pKa增加将诱导自聚集行为。因此,与蛋白分子间的结合作用及其自聚集行为是导致CT-03体内毒性的潜在原因,限制了CT-03及其类似物的活体应用。此外,基于CT-03类自旋标记物的高疏水性导致标记后的蛋白沉淀,从而降低了蛋白质距离测量的准确性。因此,trityl自由基的高亲水性对其生物医学应用至关重要。Trityl自由基OX063具有高亲水性,但它的合成具有很大的挑战。到目前为止,它的合成方法只在专利文献中报道,而且这些方法难以重复。鉴于此,本论文旨在新型水溶性trityl自由基研发,实现水溶性trityl自由基的高效合成,并通过与CT-03和OX063之间的性能比较,阐明新型水溶性trityl自由基在磁共振领域的应用潜质。方法:本论文研究包括两部分:（1）首先,以1,2,4,5-四（叔丁基硫代）苯为起始原料,经缩合、还原及羟基保护3步反应,合成芳基单体。选用对强碱正丁基锂稳定的叔丁基和TBS（叔丁基二甲基氯硅烷）作为羟基保护基,并采用两条路线实现关键中间体--三苯甲醇的高效合成。通过与过量碳酸二甲酯反应得到三苯甲醇三酯衍生物。最后,在三氟乙酸和SnCl2作用下,实现四羟基的脱保护和三苯甲醇向trityl自由基的转变,得到侧链含四个羟基的trityl自由基TFO。采用EPR及紫外可见吸收方法研究了TFO对氧气的敏感性、与白蛋白的结合、油水分配系数（正辛醇-水）、溶解度、pKa以及浓度依赖性的EPR谱线加宽,研究四羟基取代对TFO理化性质的影响。（2）通过四羟基保护的trityl单体为原料,通过探索优化合成OX063三苯甲醇实验条件:拔氢试剂、螯合剂、反应温度、反应时间、当量等进一步研究至今没有克服的OX063的合成。结果:（1）本研究实现了侧链含四羟基的trityl自由基TFO的高效合成。实验结果证实侧链取代基未影响TFO的氧气敏感性（4.2 mG/%O2）。TFO的低油水分配系数（-1.17）,高溶解度（154 mM,PBS）及相对高的自聚集浓度（3.0 mM）表明TFO具有较好的亲水性及弱自聚集倾向。更重要的是,在高浓度BSA（1mM）存在下TFO的EPR信号没有发生任何变化。以上结果均表明,本论文设计合成的TFO具有优良的理化性质。（2）在合成TFO自由基的经验基础上研究OX063关键中间体三苯甲醇合成方法的优化:采用不同的拔氢试剂、螯合剂、反应温度、反应时间、当量等对比实验表明:使用乙醚作为溶剂,TMEDA为螯合剂,可以达到10%的产率。结论:（1）本研究实现了新型水溶性侧链四羟基取代的trityl自由基TFO的高效合成。TFO保持了较窄的EPR线宽、较高的氧气敏感性、不与白蛋白结合以及在低极性条件下（如生物膜）较低的自聚集倾向等优良性质。因此,TFO在EPR及磁共振相关领域将有广泛的应用前景。本研究也为新型亲水性trityl自由基的合成提供了新的策略;（2）探索得到了OX063关键中间体--三苯甲醇的合成路线,为进一步OX063自由基的高效合成提供了可能。