【摘 要】
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饮食是人们赖以生存的物质保障和各种营养物质的来源,但由饮食中蛋白质引起的过敏反应却会给部分人群带来严重的健康问题。目前,对此类疾病仍没有有效的治疗措施,只能通过无过敏原蛋白的饮食避免发生过敏反应。因此,构建针对食物中过敏原蛋白快速、准确的检测方法对过敏人群至关重要。为此,本实验筛选出了特异性针对常见花生过敏原蛋白Ara h3和羽扇豆过敏原蛋白Lup an 1的纳米抗体,并构建基于纳米抗体的针对以上
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饮食是人们赖以生存的物质保障和各种营养物质的来源,但由饮食中蛋白质引起的过敏反应却会给部分人群带来严重的健康问题。目前,对此类疾病仍没有有效的治疗措施,只能通过无过敏原蛋白的饮食避免发生过敏反应。因此,构建针对食物中过敏原蛋白快速、准确的检测方法对过敏人群至关重要。为此,本实验筛选出了特异性针对常见花生过敏原蛋白Ara h3和羽扇豆过敏原蛋白Lup an 1的纳米抗体,并构建基于纳米抗体的针对以上两种食物过敏原蛋白的双抗夹心酶联免疫检测方法（ELISA）。实验对花生和羽扇豆过敏原的纳米抗体进行了制备、筛选及鉴定。首先,对花生、羽扇豆等过敏原全蛋白进行提取,使用提取的蛋白对羊驼进行免疫,构建了一个免疫后库容量为2.12×1011cfu、多样性为1.44×10~7cfu的纳米抗体文库。随后进行过敏原特异性纳米抗体的筛选,并通过免疫共沉淀和LC-MS/MS对纳米抗体靶向针对的过敏原蛋白进行鉴定,分别得到花生过敏原纳米抗体P43靶向针对的过敏原蛋白为Ara h3;12个羽扇豆过敏原纳米抗体（B187、B91、B66、B42、B69、B83、B157、B163、B167、B165、B40、B50）靶向针对的过敏原蛋白为Lup an 1。使用镍亲和层析和尺寸排阻层析的方法对表达的纳米抗体蛋白进行纯化,并对纯化后纳米抗体的亲和力、热稳定性、特异性以及对其他过敏原蛋白的交叉反应等方面进行表征。随后,建立了基于纳米抗体的花生过敏原蛋白Ara h3自配对双抗夹心酶联免疫检测方法。纳米抗体的筛选中只有1个针对花生过敏原蛋白Ara h3的特异性纳米抗体,因此纳米抗体P43分别作为检测抗体和捕获抗体进行双抗夹心ELISA检测方法的建立。捕获抗体P43的优化浓度为5μg/m L,检测抗体P43的优化浓度为7.5μg/m L。构建的自配对双抗夹心ELISA检测方法的最低检测限和定量限分别为53.13μg/L和189.11μg/L。对脱脂牛奶进行了添加回收实验,该方法的回收率为93.8～114.7%,变异系数低于5%,表明该方法具有较好的准确性。最后,建立了基于纳米抗体的羽扇豆过敏原蛋白Lup an 1双抗夹心酶联免疫检测方法。将12种针对羽扇豆过敏原蛋白Lup an 1的特异性纳米抗体两两配对,筛选出检测效果最优的抗体对（纳米抗体B40和B91）进行双抗夹心ELISA检测方法的建立,其优化后的浓度分别为检测抗体（B40,7.5μg/m L）和捕获抗体（B91,7.5μg/m L）。构建的双抗夹心ELISA检测方法的最低检测限和定量限分别为1.15μg/L和29.75μg/L。选取脱脂牛奶进行了添加回收实验,回收率为86.02～110.83%,变异系数低于4.0%。结果表明该方法具有较好的实用性。
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