磺胺类药物多残留ELISA快速检测试剂盒与胶体金免疫层析试纸条的初探

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实验中采用4-氨基苯甲酸甲酯(PBPA)和对乙酰氨基苯磺酰氯(ASC)为原料,经过亲和取代,酯的水解反应合成磺胺药物共有的母核结构苯甲酸对氨基苯磺酰胺(SH),应用质谱法(ESI-MS)与核磁共振氢谱法(1H-NMR)鉴定SH。质谱结果显示[M-]=291.03766,与理论值[M]=292相符,表明SH合成成功;核磁共振氢谱(1H-NMR)的数据与SH化合物的结构相符。磺胺母核人工半抗原合成成功。实验采用混合酸酐法将本实验室合成的磺胺类药物母核结构物(SH)与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)相偶联,进而合成包被原OVA-SH和免疫原BSA-SH。紫外扫描(UV)与SDS-PAGE法进行确证。利用BSA-SH免疫Balb/C小鼠,间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选细胞融合备用鼠;利用细胞融合杂交瘤技术建立了SH Mab细胞株,后体内诱生腹水法制备SHMab。对SH Mab的效价、特异性和敏感性等免疫学特性进行鉴定。结果显示BSA-SH人工抗原合成成功,SH与BSA的分子结合比约为11.6:1。5G1、5G2和8D23株敏感特异性的杂交瘤细胞株被成功筛选。其细胞上清液效价分别为:1:6.40×102、1:1.28×103和1:3.20×102,腹水效价分别为:1:2.56×105、1:5.12×105和1:1.28×105。5G2株所产腹水纯化后所得Mab对SH的半数抑制浓度(IC50)为82ng/mL。纯化后Mab对磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD)、磺胺甲基嘧啶(SM)、磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺醋酰(SCT)、磺胺氯吡嗪钠(SCZ)、磺胺噻唑(ST)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺苯吡唑(SPH)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、氨苯磺胺(SSF)和磺胺喹噁(SQ)的交叉反应率分别为:108%、86%105%、85.6%、72%、26%、32%、54.6%、43%、4.6%、0.5%和76%。获得了抗磺胺母核SH高效价、敏感、特异的Mab。实验将卵清白蛋白(OVA)与磺胺母核人工半抗原(SH)采用混合酸酐法,按投料比1:2连接制备了包被原(SH-OVA),后将辣根过氧化物酶(HRP)与SH-OVA采用过碘酸钠法,按投料比2:1连接制备了酶标抗原(SH-OVA-HRP)。直接竞争ELISA方法通过药物竞争试验被确定,在0-1000ng/mL浓度范围直接竞争ELISA建立标准曲线方程程为:y=-0.4016x+1.2187,相关系数R2=0.97,半数抑制浓度(IC50)为61.60ng/mL。SH酶联免疫检测试剂盒雏形初步研制成功。每2个月随机抽检其稳定性,4个月后稳定性良好。利用得到的Mab研制出了检测磺胺类药物多残留胶体金免疫层析试纸条雏形。试纸条用间接竞争法,选用20nm的胶体金,在pH7.8,单抗17μg/mL条件下制备金标抗体。检测线为SH-OVA,质控线用羊抗鼠IgM抗体,两条线都包被在硝酸纤维素膜上。随后对试纸条的使用材料、溶液和各种工艺进行了优化。
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