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飞蝗Locusta migratoria胚胎期发育经历多次表皮生成与降解,其表皮降解受到几丁质酶的调控。本研究通过制备飞蝗预若虫发育时期(9d-14 d)的石蜡切片,发现飞蝗预若虫表皮在11 d开始形成,之后逐渐加厚,至12 d时增至最厚;然后开始降解,与表皮细胞产生间隙,在14 d时降解蜕去。通过免疫荧光染色定位,发现LmCht5-1起始时表达于表皮细胞,并转运至细胞与表皮间隙,最后至表皮处与表皮几丁质结合。利用dsLmCht5-1干扰预若虫期LmCht5-1的表达,发现该蛋白在整个预若虫表皮蜕皮时期都表达降低,预若虫旧表皮降解受阻,引起预若虫蜕皮困难死亡。进一步通过FB28染色发现,预若虫表皮中几丁质的降解较对照组明显减少。因此我们认为LmCht5-1在飞蝗预若虫期负责对预若虫表皮中几丁质的降解。昆虫几丁质酶是个庞大的家族,在几丁质降解过程中几丁质酶(Cht5s)起重要作用,它可以催化几丁质中由β-1,4糖苷键连接的N-乙酰基葡糖胺的乙酰胺基脱去乙酰基,形成脱乙酰几丁质(壳聚糖)。课题组前期发现几丁质酶5在飞蝗中具有基因复制现象,飞蝗几丁质酶5包含LmCht5-1和LmCht5-2两个基因,其中LmCht5-1在飞蝗5龄若虫到成虫期的蜕皮发育中起重要作用,而LmCht5-2的功能尚不明确。但LmCht5-1和LmCht5-2在胚胎期的功能有待研究,LmCht5-1和LmCht5-2的功能分化也有待进一步研究抗体的缺乏限制了基因功能的研究。进一步通过基因表达谱的研究发现这两个基因在飞蝗胚胎发育时期具有不同的表达模式,可能参与不同的表皮发育过程,但其具体的分子机制并不清楚。基于课题组前期的研究,本研究以LmCht5-1为研究对象,进行原核表达,制备成功LmCht5-1的特异性多克隆抗体,并研究了基因LmCht5-1对飞蝗胚胎发育的影响。该研究为探讨基因在几丁质代谢过程中的功能特性提供了重要的基础数据,并为筛选杀虫剂新靶标,研发环境友好型杀虫剂以及以农业害虫飞蝗的几丁质作为底物的壳聚糖生产方法提供理论依据。本文主要从以下三个内容进行研究:一、飞蝗胚胎石蜡切片的改良及浆膜表皮的变化通过优化飞蝗胚胎固定前处理、洗涤、脱水和透明等步骤,改良胚胎期石蜡切片制备技术;利用改良的石蜡切片技术获得表皮结构完整清晰的飞蝗胚胎组织切片,利用HE染色研究飞蝗胚胎表皮发育规律;结果显示:(1)在30℃条件下,飞蝗胚胎浆膜表皮完全形成于胚胎发育的第5 d,在第8 d时开始降解。(2)在30℃条件下,飞蝗胚胎预若虫表皮完整形成于胚胎发育的第11 d,在第12 d时开始降解,在第14 d时彻底降解,飞蝗胚胎形成新的表皮。本研究优化了飞蝗胚胎石蜡切片制备步骤,揭示了飞蝗浆膜表皮发育模式,为昆虫胚胎表皮代谢的研究提供了基础资料。二、飞蝗LmCht5-1的原核表达、纯化及抗体制备与验证选取LmCht5-1抗原结构区域,构建质粒pET32a-OVA-LmCht5-1,将构建成功的重组质粒转入大肠杆菌中进行目的蛋白的诱导表达,将成功表达的蛋白使用Ni-NTA亲和层析柱进行目的蛋白的纯化,纯化组分采用12%SDS-PAGE方法检测其纯化结果,然后测定纯化后的蛋白浓度,将浓度达到10mg的纯化蛋白送至生物公司进行抗体制备。抗体合成后,使用Western blot技术进行抗体的验证。分别检测抗体效价与特异性,用免疫组化检测抗体的特异性,为LmCht5-1功能的深入解析功能研究提供重要的实验材料和平台条件。三、LmCht5-1基因在飞蝗胚胎发育过程中组织定位和功能分析通过免疫组化技术检测LmCht5-1基因在飞蝗胚胎发育过程中的定位及变化。通过RNAi干扰与透射电镜技术相结合的技术手段,研究LmCht5-1基因对飞蝗胚胎发育的影响。免疫组化检测结果显示,LmCht5-1定位在细胞质中。对飞蝗胚胎超微结构进行观察,结果表明LmCht5-1影响飞蝗胚胎的最后一次蜕皮,即影响飞蝗胚胎蜕变成若虫。