TIPE2,肿瘤坏死因子α诱导蛋白8-2型(Tumor necrosis factor-a-induced protein 8 like 2, TNFAIP8L2),是一个免疫负调控因子,选择性地表达于胸腺、脾脏、淋巴结等免疫器官及炎症组织,对抑制炎症发生、维持免疫稳态具有关键性作用。TIPE2不仅是一个重要的抗炎蛋白,而且是一个有潜力的肿瘤抑制因子,其过表达可以诱导细胞凋亡并抑制Ras介导的肿瘤形成。TIPE2抑炎、抗肿瘤功能的实现主要依赖于Ras、Rac信号通路。TIPE2表达异常与多种疾病的发生有关。我们实验室前期对动脉粥样化(Atherosclerosis, AS)发生机制的研究结果提示,TIPE2可能通过调控血管重构参与血管增生性疾病的发生,而且可以通过负调控巨噬细胞功能参与炎症的发生。为此,本项目一方面以血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖介导的血管重构为切入点,系统研究TIPE2在血管术后再狭窄(Restenosis)中的作用及其机制,另一方面以炎症角度探讨TIPE2通过调控巨噬细胞精氨酸代谢抑制炎症的分子机制。研究目的1.探讨TIPE2蛋白在Restenosis发生发展中的作用及分子机制；2.研究TIPE2调节精氨酸代谢抑制炎症的分子机制。研究方法一、TIPE2蛋白调控Restenosis的机制研究1. TIPE2对小鼠Restenosis发生发展的作用研究1.1 Retenosis小鼠模型构建8-10周龄的SPF级WT (C56BL/6J, B6)和TIPE2-/-小鼠(B6背景)被施以左侧颈动脉完全结扎手术,构建损伤引起的Restenosis小鼠模型。损伤后第7、14、21天处死小鼠,取小鼠双侧颈动脉,4%多聚甲醛固定后制作5μm冰冻切片,通过HE、EDU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)染色等试验检测TIPE2基因缺陷对小鼠VSMCs增殖及Restenosis发生发展的影响。1.2 TIPE2重组腺病毒感染实验8-10周龄的SPF级WT小鼠被施以左侧颈动脉完全结扎手术,同时用1×109pfu的TIPE2重组腺病毒局部感染,对照组则给以同剂量GFP腺病毒处理。术后第21天通过尾静脉再次注射同剂量病毒。第42天处死小鼠并取双侧颈动脉,通过HE染色分析TIPE2过表达对小鼠Restenosis的治疗效果。1.3 HE染色及分析冰冻切片HE染色后拍照,Image Pro Plus 6软件分析新生内膜面积、内膜／中膜比,以此评价术后再狭窄程度。1.4 EDU掺入实验Restenosis模型小鼠腹腔注射EDU (500μg/100g体重),12小时后处死小鼠,取颈动脉经4%多聚甲醛固定后OCT包埋,制作5μm厚冰冻切片。染色后统计EDU阳性细胞,分析VSMCs体内增殖情况。1.5 TUNEL染色WT、TIPE2-/-小鼠损伤第7天的颈动脉切片通过TUNEL染色后统计分析血管TUNEL阳性细胞百分比,研究TIPE2对Restenosis模型小鼠体内VSMCs凋亡的影响。2. TIPE2调控Restenosis形成的机制研究2.1小鼠原代VSMCs培养分离8-10周龄的SPF级WT或T1PE2-/-小鼠腹主动脉及颈动脉,预冷PBS充分清洗后采用Ⅰ型胶原酶和Ⅲ型弹力蛋白酶联合消化方法分离细胞,培养于高糖DMEM培养基(含15%FBS)中。平滑肌细胞分化标记基因SM-a-actin (SMαA)作为鉴定指标,流式细胞术分析鉴定后,纯度大于95%的3-8代细胞用于本课题实验研究。2.2 TIPE2调控VSMCs增殖、细胞周期分布的研究分别用CCK-8和流式细胞术检测TIPE2缺失或过表达对PDGF诱导的VSMCs增殖、细胞周期分布的影响；进一步利用realtime PCR、western blot等技术检测细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin D3的表达变化。2.3 TIPE2调控VSMCs增殖的机制研究通过Western blot、免疫荧光等方法检测TIPE2对PDGF诱导的STAT3、 ERK1/2活化以及STAT3核转位的调控作用,进一步利用STAT3、ERK1/2特异性抑制剂Stattic、PD98059处理WT及TIPE2-/- VSMCs, realtime PCR检测细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin D3的表达变化,以此验证TIPE2是否通过STAT3、ERK1/2信号通路调控VSMCs细胞的增殖。2.4 TIPE2调控STAT3、ERK1/2信号通路的机制探讨首先通过PBD Pull-Down技术研究TIPE2缺失或过表达对Rac1活化的影响；进一步利用Rac 1特异性抑制剂NSC23766以及小干扰RNA处理细胞,检测STAT3、ERK1/2磷酸化水平及STAT3在细胞核的募集程度,以此验证TIPE2是否通过Rac1调控STAT3、ERK1/2信号通路活化以及STAT3活化后的核转位过程。二、TIPE2蛋白调控巨噬细胞精氨酸代谢的研究1.巨噬细胞除菌功能检测取对数生长期的Eco.li (DH5α)感染WT或jIPE2-/-小鼠腹腔巨噬细胞30min,洗去游离细菌后细胞用iNOS抑制剂1400w(100 μM)处理2 h；1400w处理前后的细菌活力通过集落形成单位(colony forming unit, CFU)进行分析,并以此计算巨噬细胞对Eco.li的杀伤率。2. TIPE2稳定表达细胞株构建Raw264.7细胞分别转染TIPE2-pRK5或对照质粒,48h后开始加500 mg/mLG418进行筛选。14天后,分离抗性克隆并于DMEM完全培养基(含10%FBS,200μg/mL G418)培养、扩增。3.腹腔巨噬细胞分离培养8-10周龄的SPF级WT、TIPE2-/-小鼠腹腔注射1 mL浓度为6%的无菌淀粉溶液；72 h后颈椎断裂法处死小鼠,于超净台内用10mL DMEM培养基或者PBS冲洗小鼠腹腔；离心腹腔淋洗液、收集细胞,重悬至合适密度后铺于细胞培养板；4h后换液,去除未贴壁细胞。贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞。4.细胞处理WT、TIPE2-/-腹腔巨噬细胞或Raw264.7巨噬细胞以适当密度铺板,过夜培养后100ng/mL LPS刺激,根据不同检测要求确定刺激时间,具体如下：a)LPS刺激Oh、2h、4h或6 h,收细胞抽提总RNA,逆转录后realtime PCR检测iNOS、arginase的表达；b)LPS刺激24 h后收上清,检测NO及尿素氮水平；收细胞抽提总蛋白,用western blot检测iNOS表达变化；c) LPS刺激0 min、15 min、30 min、60 min或120 min,收细胞抽提总蛋白,western blot检测NF-κB及MAPK的活化情况。5.小鼠模型构建及分析8-10周龄的SPF级WT、TIPE2-/-小鼠按1.5 mg/kg体重的剂量腹腔注射LPS,分别于0h、3h或24 h采血,收取肝、肺组织；血清用于NO、尿素等测定,肝肺组织通过reltime PCR、western blot检测iNOS、arginase Ⅰ及arginase Ⅱ的表达。研究结果1. TIPE2蛋白抑制实验性Retenosis的发展1.1 TIPE2抑制损伤引起的Restenosis发展两种基因型Restenosis模型小鼠颈动脉切片后经HE染色,软件分析新生内膜面积(Neointima area, NIA)、内膜与中膜厚度比(Intima/Media, I/M)。结果发现TIPE2缺失显著促进损伤引起的血管再狭窄。损伤后第14天,基因缺陷导致的疾病进展差异开始体现,TIPE2-/-小鼠NIA、I/M值分别是WT小鼠的1.9倍、1.8倍。第21天,差异进一步扩大。TIPE2-/-小鼠的NIA由14天的1.9倍上调至3.4倍,而I/M值更是扩大到WT小鼠的4.7倍。TIPE2过表达显著抑制损伤引起的血管术后再狭窄。血管损伤6周时,TIPE2过表达组的NIA及I/M值分别为19.36±2.905×103μm2、0.8888±0.1374,显著低于对照组的37.78±2.402×103μm2、1.88510.1794。这些结果说明TIPE2可以抑制小鼠Restenosis的发生发展。1.2 TIPE2不影响VSMCs凋亡但抑制损伤引起的细胞增殖利用EDU体内标记技术、TUNEL染色检测WT、TIPE2-/-模型小鼠的VSMCs增殖、凋亡情况,结果发现TIPE2缺失促进VSMCs增殖,但对细胞凋亡没有明显影响。损伤后第7天,TIPE2缺失组的血管中膜EDU阳性细胞率显著高于WT组(TIPE2-/- vs.WT,21.69±2.639% vs.9.58±1.625%, P=0.0175),而TUNEL阳性细胞率则与WT组没有显著性差异(TIPE2-/- vs. WT,5.77±1.925% vs. 6.03±1.310%,P=0.9136),提示TIPE2主要通过调控VSMC增殖抑制Restenosis的发生发展。1.3损伤及PDGF-BB刺激显著上调VSMCs的TIPE2表达PDGF-BB刺激原代培养的VSMCs可以显著上调TIPE2 mRNA及蛋白表达。与此相似,损伤后第7天、14天,WT模型小鼠的血管中膜TIPE2表达水平均有不同程度的上调,但第14天的表达强度低于第7天,总体上呈现升高后逐渐恢复的趋势。1.4 TIPE2通过调控Cyclin D1、Cyclin D3的表达抑制VSMCs增殖体外利用PDGF-BB刺激WT、TIPE2-/- VSMCs,分析细胞周期分布。结果发现,TIPE2缺失加快细胞从Go/G1期向S期转换,并伴随着Cyclin D1、CyclinD3的上调。而TIPE2过表达则显著下调D型周期蛋白表达及细胞周期转换效率,从而抑制细胞增殖。TIPE2 R24A突变体(该突变体基本丧失与Rac1结合能力)对细胞周期蛋白及周期转换均没有明显影响,提示TIPE2对细胞增殖的调控可能依赖于Rac1信号通路。1.5 TIPE2通过抑制Racl-STAT3、Racl-ERK信号通路调控VSMCs增殖比较Rac1、STAT3及ERK信号分子在WT及TIPE2-/-VSMCs的活化水平差异,结果发现TIPE2缺失显著增强Racl、STAT3以及ERK的活化,而TIPE2过表达则结果相反。此外,Rac1抑制剂NSC23766抑制Rac1的活性后,TIPE2对STAT3及ERK1/2的抑制作用消失,联合应用STAT3、ERK1/2抑制剂处理VSMCs, TIPE2缺陷导致的Cyclin D1、Cyclin D3表达上调现象消失,说明TIPE2主要通过Racl-STAT3、Racl-ERK信号通路调控VSMCs增殖。1.6 TIPE2调控STAT3活化后核转位的机制TIPE2可以抑制STAT3活化,TIPE2基因缺失显著促进STAT3在细胞核内的募集。进一步利用活化突变体STAT3-C过表达的HEK293细胞以及WT VSMCs研究TIPE2是否对活化后STAT3入核过程具有直接调控作用。结果发现TIPE2及Rac1抑制剂能够显著抑制STAT3-C的入核,且TIPE2的抑制作用能够被Racl-Q61L (Racl活化突变体)消除,说明TIPE2以Rac1依赖方式调控STAT3的核转位过程。2. TIPE2通过调控巨噬细胞精氨酸代谢抑制炎症反应2.1 TIPE2基因缺失增强NO介导的抗菌作用与WT相比,TIPE2-/-腹腔巨噬细胞具有更强的抗菌功能(杀菌率：TIPE2-/-vs. WT,68.57±4.234%vs.46.53±4.347%, P=0.0221),而iNOS抑制剂1400w处理能显著缩小两者的差距(TIPE2-/- vs. WT,51.93±3.726%vs.36.87±5.095%, P=0.0378),说明TIPE2缺失促进NO介导的杀菌作用。2.2 TIPE2过表达降低Raw264.7巨噬细胞的iNOS水平,同时促进精氨酸酶的表达巨噬细胞中NO的产生主要依赖于iNOS。为了研究TIPE2是否调控iNOS表达,我们构建了稳定表达TIPE2的Raw264.7巨噬细胞系,LPS刺激后检测iNOS表达变化。结果发现,TIPE2过表达抑制LPS诱导的iNOS表达,同时显著上调精氨酸酶Ⅰ(Arginase I,ARG1)的mRNA水平,而对精氨酸酶Ⅱ (Arginase Ⅱ,(ARG2)则没有明显的影响。这些结果提示,TIPE2可能通过调控iNOS与ARG1的表达水平,影响精氨酸代谢途径的转换。2.3 TIPE2过表达抑制Raw264.7巨噬细胞NO、但促进尿素(Urea)的产生Arginase与iNOS均以精氨酸(Arginine)为底物,在精氨酸代谢上互为竞争关系。为了证明TIPE2调节iNOS及ARG表达水平确实改变了巨噬细胞在精氨酸代谢上的倾向,我们对这两个酶的产物进行检测。结果发现,TIPE2过表达细胞的尿素水平比对照组高,而NO水平则显著低于对照组,说明TIPE2过表达调控Raw264.7巨噬细胞的精氨酸代谢途径选择倾向,导致精氨酸代谢从iNOS途径转向arginase途径。2.4 TIPE2缺失促使巨噬细胞精氨酸代谢从iNOS向arginase途径转换进一步利用TIPE2缺陷的巨噬细胞反向验证TIPE2调控精氨酸代谢的功能,发现,LPS刺激后TIPE2-/-巨噬细胞iNOS表达水平、NO水平显著高于WT细胞；而ARGI mRNA及尿素水平则显著低于对照组。该结果从功能缺失的角度进一步验证TIPE2改变巨噬细胞精氨酸代谢倾向的功能。2.5 TIPE2缺陷促进小鼠体内iNOS表达及NO产生利用败血症模型小鼠体内验证TIPE2调控精氨酸代谢的功能,发现LPS刺激后,TIPE2缺陷小鼠肝、肺组织的iNOS mRNA及蛋白水平显著高于WT小鼠,其血清NO也比WT小鼠高：相应的,TIPE2-/-小鼠肝、肺组织里的ARG1的表达水平则比WT小鼠低。2.6 TIPE2缺陷促进小鼠巨噬细胞NF-KB.JNK及p38信号通路的活化文献报道,NF-κB、MAPK信号通路是LPS上调巨噬细胞iNOS表达重要机制。因此,我们检测了WT、TIPE2-/-小鼠腹腔巨噬细胞中LPS诱导的通路活化情况。结果发现,TIPE2缺失后IκB的磷酸化水平及降解程度均显著提高,JNK及p38磷酸化水平也明显提高,而ERK1/2活化仅有微弱的增强。该结果提示TIPE2可能主要通过NF-κB、JNK及p38信号通路抑制iNOS表达及其介导的炎症反应。结论1.TIPE2通过抑制VSMCs增殖抗实验性Restenosis.TIPE2抑制Racl导致下游ERK1/2以及STAT3活化、入核等过程受阻是TIPE2抑制VSMCs增殖、抵抗Restenosis的主要分子机制。2.TIPE2抑制LPS引起的iNOS上调,使巨噬细胞中精氨酸优先代谢为尿素,从而发挥抗炎作用。创新点及意义1.首次系统研究TIPE2在Restenosis中的作用,提出TIPE2对STAT3活化及核转位的调控作用是抗Restenosis的主要分子机制；2.初步探讨TIPE2作为疾病治疗靶点的可行性,为以VSMCs增生为病理基础的相关疾病的临床干预提供了新的靶点；3.提出TIPE2调控精氨酸代谢抗炎的新机制。