桃芽自然休眠相关基因IRE1、bZIP60的克隆与功能鉴定

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:xyw6623
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对落叶果树而言,芽休眠是其为抵御冬季低温产生的一种生物适应性。随着设施果树的发展,芽休眠特性已经成为果树生产重要的限制因子之一。休眠期直接决定着生产中扣棚升温的时间,从而关系着果品上市时间和生产效益。因此研究设施果树休眠进程进而进行果树的熟期调控,具有重要的现实意义。本研究以5年生常用油桃栽培品种‘曙光’(Prunus persica(L.)Batsch cv.Nectarina Shuguang)为材料,通过透射电镜观察花芽生长点细胞在自然休眠进程中超微结构变化。利用荧光定量分析了内质网应激信号通路关键基因在休眠进程中的变化规律,推测这些关键基因与芽自然休眠的关系。同时,对种子层积休眠解除过程中生长点细胞的超微结构变化和内质网应激相关基因表达变化进行检测,探讨种子休眠和芽自然休眠的关系。选用高需冷量品种‘超红’(Prunus persica(L.)Batsch cv.Nectarina Super Crimson,需冷量为800 C.U.)和低需冷量品种‘五月阳光’(Prunus persica(L.)Batsch cv.Nectarina May Glo,需冷量为200 C.U.),检测需冷量对PpIRE1、PpbZIP60表达的影响的影响。最后构建PpIRE1、PpbZIP60基因的拟南芥超表达和突变体互补株系,验证桃PpIRE1、PpbZIP60基因对拟南芥种子萌发的影响,推测其在桃自然休眠中的功能。主要研究结果如下:1、桃树花芽自然休眠和种子休眠过程中超微结构的变化存在一致性。主要表现在,在休眠期间,细胞质由稀变浓;细胞核体积逐渐增大,核仁逐渐松散;细胞膜、核膜、质膜等膜系统结构由不完整变得完整,界限由模糊变得清晰;胞间连丝由少、细变多、粗,在种子休眠解除后甚至出现胞间通道,细胞间通过胞间连丝进行的物质交流日益频繁。线粒体大量增殖,个体增大,同时内部嵴结构也逐渐变得清晰,为发芽后的迅速生长和分化作准备。内质网的面积和数量都大大增加,休眠后期在大液泡周围、质膜边缘及核膜附近都有规则排列的短小的内质网,形成了物质转运的通道;高尔基体数量由少变多,囊状片层的结构越来越清晰完整;内质网和高尔基体是蛋白质的合成及加工成熟的场所,它们的增加反映了细胞中代谢酶等蛋白质类合成活动的增加。休眠前期质体、质体中的淀粉粒、脂肪滴数量众多,随着休眠的解除,逐渐变得越来越少。2、在芽自然休眠和种子自然休眠前期,内质网应激的标志因子BiP(BiP1和BiP2)均发生积累,可见在这个过程中发生了内质网应激。在自然休眠进程中IRE1-bZIP60,bZIP28-NF-Y两条信号通路的关键基因PpIRE1a、PpIRE1b、PpbZIP60、PpbZIP28、PpNF-YA4、PpNF-YB3和PpNF-YC2转录水平的变化趋势基本都是先升后降,与休眠进程密切相关,可能参与休眠的调控。在桃树没有遗传转化体系的情况下,可以通过异位表达拟南芥观察其种子萌发接推测基因的功能。3、‘超红’和‘五月阳光’自然休眠过程中,PpIRE1、PpbZIP60基因在mRNA水平表达差异不显著。4、通过将PpIRE1、Ppb ZIP60基因在拟南芥野生型中超表达,在播种后4d、8d、12d分别观察统计超表达株系的种子萌发率,结果表明,二者超表达基因的拟南芥株系的种子萌发率虽然与野生型差异不显著,但是萌发时间有了明显提前,在4d时均能全部萌发,比野生型的8d缩短一半时间。5、对T-DNA插入突变体株系纯合株系Sail283B03(bzip60-1)、Salk050203(bzip60-2)、Salk018112(ire1-1)和Sail1256F04(ire1-2)种子萌发率试验发现,bzip60-1、ire1-1在播种后12d的种子萌发率均能达到98%作用,与野生型100%的萌发率相比差异不显著。而bzip60-2、ire1-2在播种后12d的种子萌发率仅为20%和15%,显著低于野生型。选取bzip60-2、ire1-2突变体构建PpIRE1、PpbZIP60基因的突变体功能互补株系,对T3代种子萌发率进行统计分析。结果发现,突变体互补株系萌发率比突变体株系显著提高,其中35S::PpIRE1/ire1萌发率比ire1突变体提高三倍多,互补株系表型部分恢复;35S::PpIRE1/ire1萌发率也较bzip60突变体提高两倍左右。PpIRE1、PpbZIP60高表达能够缩短拟南芥种子休眠,从而推测PpIRE1和PpbZIP60基因表达利于打破桃休眠。通过该研究,初步明确了部分内质网应激信号通路关键基因参与休眠进程的调控,在细胞水平和基因水平进一步验证前人关于芽休眠和种子休眠存在一致性的猜测,对进一步对PpIRE1和PpbZIP60的功能进行了验证。为从分子水平上揭示桃树芽休眠机制的研究奠定了基础,为深入制定熟期调控措施提供了依据。
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