目的皮肤损伤愈合大致分为三个阶段，即炎症期、纤维增生期和组织重建期。多核粒细胞、单核细胞和成纤维细胞参与皮肤损伤愈合的全过程，清除损伤、坏死的皮肤组织和入侵的病原体并重建损伤组织，对于损伤愈合具有重要作用。在炎症期和纤维增生期损伤区内多核粒细胞、单核细胞和成纤维细胞的数量急剧增加；在组织重建期，这三种细胞的数量则显著减少，直至伤口完全愈合。粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK，也称pp^125FAK)是人们最初在用v-src转化细胞时发现的一个主要酪氨酸磷酸化蛋白，是整合素信号转导中的关键分子之一，在细胞粘附过程中发挥着非常重要的作用。当被整合素激活时FAK自身磷酸化，能够直接或者通过相关激酶激活PI-3K（phosphatidylinositol 3-kinase，PI-3K）、MAPK（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和STAT（signal transducer and activator of transcription，STAT）等信号转导分子，进而与细胞内一些相关的信号转导途径相联系，参与细胞信号转导过程。这些细胞内分子的相互作用在信号转导途径中调节各种各样的细胞功能，如扩散、迁移、增殖、凋亡和细胞的存活。本研究用免疫组织化学染色技术和Western blot方法检测小鼠皮肤切创愈合过程中FAK和磷酸化FAK在多核粒细胞、单核细胞及成纤维细胞中的表达，进而探讨通过FAK的信号转导途径及其生物学作用，并讨论通过检测FAK和磷酸化FAK表达的规律推测皮肤损伤时间的可行性，进一步揭示蛋白质的磷酸化对皮肤损伤愈合的影响。材料和方法1、动物模型的建立及分组健康成年清洁级昆明系小鼠33只，雌雄不限，体重35-40g，随机分为11组，每组3只，其中1组为正常对照组，其余各组做为实验组。乙醚气体吸入麻醉，剪毛处理，常规手术消毒，在背部中央做一纵行长1.5cm皮肤全层切口，深达筋膜。创面自然止血，不包扎，不施药。切创后每只小鼠分笼饲养，给予消毒饲料及双蒸水并保持伤口干燥、防止伤口感染。分别于伤后0h、3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d将小鼠脱颈椎处死，取伤口处1.0cm×1.5cm皮肤组织。对照组小鼠取相同部位同等大小皮肤。每组1／2皮肤固定后石蜡包埋，制作5μm厚度连续切片；另1／2皮肽匀浆，离心，取上清。2、FAK和磷酸化FAK的免疫组织化学染色（SP法）（1）切片脱蜡，水化；（2） 3％H₂O₂／PBS灭活内源性过氧化物酶，室温25min；（3） PBS洗涤切片后进行抗原修复，置于10mM pH 6.0的柠檬酸缓冲液中，微波炉加热至96℃，持续3min，三次、计10min；（4）切片冷却至室温，用PBS（pH 7.2-7.4）洗涤切片后滴加正常山羊非免疫血清，室温下保湿盒内孵育25min；（5）滴加用抗体稀释液1：200倍稀释的兔抗小鼠FAK或磷酸化FAK多克隆抗体，保湿盒内4℃孵育过夜；（6） PBS洗涤切片后滴加生物素标记的山羊抗兔IgG抗体，保湿盒内孵育25min；（7） PBS洗涤切片后滴加SP试剂，保湿盒内孵育25min；（8） PBS洗涤切片后用新配制的DAB显色3min；（9）苏木素核复染1min，1％盐酸-酒精中分化后在自来水中返蓝10min；（10）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。实验中以PBS替代一抗作阴性对照，未见假阳性。每组同时作HE染色。3、阳性细胞计数分析显微镜×400倍下，在每张切片中随机选择10个视野计数包括多核粒细胞、单核细胞及成纤维细胞的阳性细胞。计算每个视野中阳性细胞与此三种细胞总数的比值。（1）结果判断FAK和磷酸化FAK阳性表达均位于细胞浆，用DAB显色呈棕黄色。（2）统计学分析各损伤时间组数据应用SPSS 11.0 for Windows统计软件，采用单因素方差分析方法进行统计学处理，数据以（?）±s表示。4、FAK和磷酸化FAK的Western blot检测（1）蛋白样本制备；（2）蛋白定量；（3）电泳，100μg／lane，10％[w／v]SDS-PAGE，以标准分子量Marker作指示；（4）转印；（5）封闭抗原，5％脱脂牛奶和0.1％Tween-20封闭液；（6）兔抗小鼠FAK或磷酸化FAK多克隆抗体孵育；（7）羊抗兔抗体孵育，以GAPDH为内参；（8） ECL显色。（9）结果判断检测FAK和磷酸化FAK，在125kD显示阳性谱带。实验结果1、皮肤损伤愈合过程的病理组织学变化伤后3h组损伤区出现少量多核粒细胞。6h组见多核粒细胞数量明显增加。12h组皮下组织内有大量渗出的多核粒细胞。1d组损伤区有大量的多核粒细胞及单核细胞浸润。伤后3d～5d以单核细胞和成纤维细胞为主。伤后7d组表皮增生明显，10d和14d组完全覆盖伤口。2、FAK和磷酸化FAK在皮肤切创愈合过程中损伤区及损伤周边区的表达（1） FAK在对照组中小鼠的表皮、毛囊、皮脂腺、汗腺上皮细胞和血管内皮细胞均呈阳性染色。实验组伤后0h组织切片染色与对照组基本相同。3h开始出现阳性细胞，伤后6h～12h，大部分浸润的多核粒细胞和单核细胞为阳性。1d～3d成纤维细胞大量增生，几乎全部阳性着色。5d～10d阳性着色逐渐减弱，到14d呈最弱表达。（2）磷酸化FAK在对照组中小鼠表皮、毛囊、皮脂腺、汗腺上皮细胞和血管内皮细胞亦有阳性染色，但其表达强度较FAK弱。实验组伤后3h开始出现阳性细胞，12h阳性染色最为明显，之后表达强度稍有减弱，5d～7d逐渐减弱，14d仅有微弱表达。3、阳性细胞计数及统计学分析（1） FAK：伤后3h之内，FAK的阳性细胞率较低（9.34％±1.42％），6h组阳性细胞比率开始升高（21.57％±0.91％），12h阳性细胞比率继续升高（29.51％±0.76％），1d组阳性细胞比率升高明显（36.22％±1.96％），在伤后3d，阳性细胞比率达到最高（53.48％±2.74％）。5d组阳性细胞比率开始下降（45.17％±3.21％），7d组阳性细胞比率继续下降（39.96％±1.77％），10d组该比率下降为（26.71％±2.33％），伤后14d FAK阳性细胞比率降到最低（12.15％±1.64％）。经统计学方差分析，除0h组外FAK各时间段相邻两组之间阳性细胞比率差异有统计学意义（P＜0.01）。（2） phospho-FAK：伤后3h之内，phospho-FAK的阳性细胞率较低（5.48％±3.23％），6h组阳性细胞比率迅速升高（36.32％±3.76％），12h组阳性细胞比率最高，达（67.58％±2.87％），1d组阳性细胞比率稍有下降（55.65％±3.51％），在伤后3d，阳性细胞比率继续下降（47.52％±3.89％）。5d组阳性细胞比率下降为（39.71％±6.53％），7d组阳性细胞比率下降到（33.08％±3.19％），10d组该比率继续下降（20.14％±4.87％），伤后14d阳性细胞比率降到最低（8.29％+3.54％）。经统计学方差分析，除0h组外phospho-FAK各时间段相邻两组之间阳性细胞比率差异有统计学意义（P＜0.01）。4、Western blot结果分析FAK在对照组及实验组均有表达，位于125kD处。在实验组FAK表达强度变化不是十分明显，但仍可见在3d时达到高峰。磷酸化FAK亦位于125kD处，在空白对照组及0h组表达较弱，在3h组表达略增强，6h开始显著增强，至12h组显色最强，此后逐渐下降，至14d组呈弱阳性表达。结论1、正常皮肤的表皮层、毛囊、皮脂腺和血管内皮中表达FAK及磷酸化FAK，提示FAK在生理状态下就发挥生物学作用。2、小鼠皮肤切创愈合过程中，FAK和phospho-FAK在多核粒细胞、单核细胞及成纤维细胞中表达，并且在小鼠皮肤切创愈合过程中，FAK对于多核粒细胞和单核细胞的聚集、迁移及成纤维细胞的增殖起着重要作用。3、在小鼠皮肤切创愈合过程中，FAK和phospho-FAK阳性细胞率呈时间规律性变化，表明FAK和phospho-FAK可作为推断皮肤切创损伤时间的指标，且phospho-FAK要优于FAK。