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Rett综合征（Rett Syndrome,RTT）是一种进行性神经发育障碍性疾病,在儿童早期发育过程中,患者常常表现出严重的智力和行为发育障碍,通常还会伴有一系列类似自闭症的症状。大多数RTT患者发生与X染色体连锁的甲基Cp G结合蛋白-2（Methyl-Cp G-binding Protein2,MECP2）基因突变,临床上多见于女性患病,偶有男性患者,但多于2岁左右死亡。基于伦理和研究材料的限制,我们对RTT患者早期生长发育过程缺乏比较完整的认识。而啮齿类和灵长类在中枢神经系统存在进化上的差异,因此,使用非人灵长类动物模型进行神经系统性疾病的建模,一方面可以作为临床研究的材料和数据补充,另一方面也能让研究人员更好地了解复杂神经系统的进化和发育过程。我们首次建立了临床高发热点MECP2-T158M突变的RTT非人灵长类疾病动物模型,并发现其具有RTT患者类似的行为表型以及异常发育的大脑结构。为了进一步探究RTT对早期神经发育过程的影响,我们将从体内和体外两个部分展开研究。体内研究可以使我们得到最直接的证据和数据,而体外研究一是为了弥补当前对RTT患者以及模型猴疾病早期神经发育过程的研究空白,其次则是希望将来能够与体内研究结果相结合,对关键致病因子及其功能进行体外验证后又重新返回到模型体内进行进一步的基础和转化研究。因此,本实验将利用非人灵长类动物诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PSCs）进行体外神经自发分化研究,预期将获得MECP2-T158M突变影响神经发育过程的关键时间节点和致病因子,尝试解答MECP2基因突变在RTT早期神经系统发病过程中的作用机理。主要研究内容和结果如下:1.建立野生型（Wild type,WT）与MECP2-T158M突变型（T158M）的猴i PSCs首先分别对WT和T158M突变猴的成纤维细胞建系,通过重编程的方法将其诱导成为多能干细胞,并获得可进行长期维持培养和扩增传代的猴i PSCs细胞系。对i PSCs进行MECP2基因型鉴定,根据鉴定结果将其分为WT和T158M突变组,作为后续实验的研究对象。2.猴i PSCs来源的神经干/前体细胞（neural stem/progenitor cells,NSC/NPCs）自发分化为神经元和神经胶质细胞等神经谱系细胞通过神经自发分化培养方案,从体外探究WT和T158M突变型i PSCs,在神经诱导和自发分化过程中,MECP2基因的正常表达时间窗口及其突变后相应阶段细胞特异性标志基因表达水平的变化情况,从而进一步探究T158M突变对早期神经分化过程的影响。实验结果表明,非人灵长类动物模型来源的WT和T158M突变i PSCs均可以向神经谱系进行定向诱导成为NSC/NPCs,在后续的自发分化培养条件下可以向神经元等多种神经谱系细胞进行分化,且与正常细胞相比,T158M突变型细胞在分化过程中Me CP2的表达时间与表达量不同。3.研究WT和T158M突变i PSCs在体外神经自发分化过程中的变化在神经自发分化培养体系下,比较WT和T158M突变型i PSCs在神经诱导和自发分化过程中,细胞表现异常的时间节点,进一步探究T158M突变对神经发育和分化过程的影响。在自发分化过程中设置几个不同的时间点进行细胞样本收集与实验验证,主要包括:通过细胞免疫荧光染色、RT-q PCR和Western blot等技术,分别在WT和T158M突变细胞的i PSCs阶段,NSC/NPCs阶段以及自发分化后的第10天、第20天和第30天的五个时间点,分析和比较WT和T158M突变i PSCs在体外神经自发分化过程中,不同水平发生的变化有哪些。实验结果表明,T158M突变对猴i PSCs的神经诱导与自发分化进程有不良的影响,主要表现在以下几个方面:T158M突变NSC/NPCs细胞生长活力增强,可能是导致NSC/NPCs自我更新增殖能力较强和分化进程改变的重要原因之一;自发分化后的T158M突变神经元形态结构发育不良,表现为神经突起数量减少,结构不完整,可能会使神经元的形成受到损害;RT-q PCR和Western blot结果显示与分化第30天的野生型细胞相比,T158M突变细胞有MECP2基因表达趋势升高但较低的Me CP2蛋白表达量,分化过程中观察到细胞的异常形态主要见于NSC/NPCs向神经细胞自发分化这一过程中。因此,我们认为MECP2-T158M突变主要对猴NSC/NPCs向神经细胞分化这一过程产生不良影响;受该位点突变的影响将导致MECP2基因的正常表达时序紊乱,进而使其调控的一系列基因表达和调控发生异常;Me CP2蛋白翻译过程也可能受到突变的影响;此外,该突变还对神经元的突起结构造成了不良影响,从而可能影响神经元功能的正常行使。结论:MECP2基因在神经系统发育过程中发挥着十分重要的作用,T158M位点的突变足以使体外神经自发分化培养的细胞形态表现异常。主要表现为NSC/NPCs阶段的T158M突变细胞具有比野生型细胞更强的细胞生长活力,自发分化后的神经元则具有较野生型神经元更稀疏与受损的神经突起结构。病理表型主要发生在NSC/NPCs向神经元分化这一过程中。因此,我们可以利用WT和T158M突变i PSCs研究RTT对早期神经发育过程和神经谱系细胞分化潜能带来的不利影响,从而进一步探究RTT在早期神经发育过程中潜在的分子作用机制、找寻和验证新的治疗靶点。